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大肠杆菌LTB增强PRRSV-GP5蛋白免疫原性的研究

作　者: 王朝文
导　师: 吴润；王一成
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: PRRSV GP5 免疫原性 LTB 免疫增强
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

【目的】为研究LTB的佐剂特性,在对LTB和GP5进行了表达条件及纯化方法优化的基础上,以LTB为免疫佐剂,GP5为模式抗原进行小鼠及仔猪免疫试验,为研究新型PRRSV疫苗探寻新途径。【方法】对GP5蛋白原核表达的诱导时间、IPTG浓度、表达菌裂解液及表达蛋白纯化条件进行了优化;对LTB蛋白真核表达的诱导时间、甲醇浓度、表达培养基蛋白浓度、表达菌起始浓度及表达蛋白纯化方法进行了优化;将雌性ICR小鼠分为8组,每组10只,分别为PBS阴性对照组、GP5+弗氏佐剂阳性对照组、GP5肌肉注射组、GP5+LTB肌肉注射组、GP5皮下注射组、GP5+LTB皮下注射组、GP5滴鼻组和GP5+LTB滴鼻组,三免后以间接ELISA法检测血清抗体,以MTT法检测淋巴细胞增殖;将1～2日龄仔猪随机分为4组,每组10只,分别为GP5滴鼻组、GP5+LTB滴鼻组、GP5注射组及GP5注射+LTB滴鼻组,二免后以间接ELISA法检测血清抗体。【结果】GP5蛋白表达及纯化最佳条件:1mmol/L的IPTG诱导3.5h,裂解液为pH7.8的8mol/L尿素,洗涤液为pH5.0和pH4.5的8mol/L尿素,洗脱液为pH4.0的8mol/L尿素,表达蛋白能与PRRSV阳性猪血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。LTB蛋白表达及纯化最佳条件:在1×BMMY中培养表达菌至OD600=4,1%(W/W)甲醇诱导96h,55%饱和硫酸铵沉淀后Ni-NTA柱一次亲和层析,D(+)-Immobilized galactose二次亲和层析,纯化后的LTB以五聚体形式存在,具有结合GM1的生物学活性;小鼠三免后GP5+弗氏佐剂组血清抗体水平最高,GP5+LTB免疫组抗体水平显著高于GP5免疫组,肌肉注射免疫组抗体水平明显高于皮下注射组,滴鼻免疫组没有检测到特异性血清抗体;MTT法检测结果表明,GP5+弗氏佐剂组、GP5+LTB肌肉注射和GP5+LTB皮下注射组B淋巴细胞增殖显著,除了GP5+弗氏佐剂组外,其他各免疫组均无明显的脾脏T淋巴细胞增殖反应。仔猪实验表明,LTB具有一定的黏膜免疫增强作用,GP5+LTB免疫组抗体水平高于GP5免疫组,GP5注射+LTB滴鼻免疫组血清抗体水平增幅大于GP5+LTB滴鼻组。【结论】建立了GP5原核表达纯化及LTB真核表达纯化的最优方法;小鼠免疫试验表明,LTB经肌肉和皮下途径免疫后能够有效地增强GP5蛋白的免疫原性,具有良好的体液免疫增强作用;仔猪免疫试验表明,LTB通过滴鼻方式免疫同样可以增强GP5蛋白的免疫原性,具有一定的黏膜佐剂作用。

全文目录

摘要  3-4
Summary  4-8
缩写词英汉对照表  8-9
第一章绪论  9-17
  1 大肠杆菌不耐热肠毒素B 亚基的研究概况  9-12
    1.1 LT 的结构和功能  9-10
    1.2 LTB 的免疫原性及黏膜佐剂研究  10-12
      1.2.1 LTB 的免疫原性表位  10
      1.2.2 LTB 的免疫原性  10-11
      1.2.3 LTB 的黏膜免疫佐剂作用  11-12
    1.3 存在的问题及展望  12
  2 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 蛋白的研究概况  12-16
    2.1 PRRSV 的结构  12-13
    2.2 GP5 蛋白的研究现状  13-15
      2.2.1 GP5 蛋白特性  13
      2.2.2 GP5 蛋白的免疫作用  13-14
      2.2.3 GP5 蛋白的生物学功能  14-15
    2.3 存在的问题及展望  15-16
  3 研究的目的和意义  16
  4 研究的内容和方法  16-17
第二章 PRRSV-GP5 蛋白的原核表达条件与纯化技术的优化  17-24
  1 材料与方法  17-19
    1.1 材料  17
    1.2 方法  17-19
      1.2.1 种子菌的制备  17-18
      1.2.2 GP5 蛋白表达条件优化试验  18
      1.2.3 蛋白纯化条件优化  18
      1.2.4 大批量制备GP5 表达蛋白  18-19
      1.2.5 ELISA 检测表达蛋白的免疫原性  19
  2 结果与分析  19-22
    2.1 基因工程菌表达条件的优化  19-20
      2.1.1 诱导时间优化  19
      2.1.2 IPTG 浓度优化  19-20
    2.2 重组蛋白的纯化  20-21
      2.2.1 表达裂解液的比较  20
      2.2.2 洗涤液优化  20-21
    2.3 大量纯化重组蛋白  21-22
    2.4 表达蛋白反应原性鉴定  22
  3 讨论  22-24
第三章 LTB 蛋白真核酵母表达条件与纯化技术的优化  24-31
  1 材料与方法  24-26
    1.1 材料  24
    1.2 方法  24-26
      1.2.1 种子菌的制备  24
      1.2.2 LTB 蛋白表达程序及检测方法  24-25
      1.2.3 发酵条件优化试验  25
      1.2.4 LTB 蛋白提纯试验  25-26
      1.2.5 LTB 蛋白特性检测  26
  2 结果与分析  26-30
    2.1 LTB 酵母工程菌表达条件的优化  26-28
      2.1.1 诱导时间优化  26-27
      2.1.2 甲醇浓度优化  27
      2.1.3 表达培养基浓度优化  27
      2.1.4 表达菌起始浓度优化  27-28
    2.2 LTB 蛋白提纯试验  28-29
      2.2.1 硫酸铵饱和度优化  28
      2.2.2 二步法亲和层析提纯LTB  28-29
    2.3 LTB 蛋白特性检测  29-30
      2.3.1 非变性SDS-PAGE 电泳检测  29
      2.3.2 GM1-ELISA 检测LTB 与神经节苷脂的结合能力  29-30
  3 讨论  30-31
第四章 LTB 增强 PRRSV-GP5 蛋白免疫原性的研究  31-38
  1 材料与方法  31-34
    1.1 材料  31-32
      1.1.1 表达蛋白  31
      1.1.2 主要试剂  31-32
      1.1.3 实验动物  32
      1.1.4 主要仪器  32
    1.2 方法  32-34
      1.2.1 小鼠免疫试验  32-33
      1.2.2 仔猪免疫试验  33-34
  2 结果与分析  34-37
    2.1 最佳抗原包被浓度结果  34
    2.2 小鼠抗体水平检测结果  34-35
      2.2.1 皮下免疫的体液检测结果  34
      2.2.2 肌肉免疫体液检测结果  34
      2.2.3 滴鼻免疫的体液检测结果  34-35
      2.2.4 不同免疫途径的体液检测  35
    2.3 小鼠细胞免疫检测结果  35-36
      2.3.1 小鼠B 淋巴细胞增殖的检测结果  35
      2.3.2 小鼠T 淋巴细胞增殖的检测结果  35-36
    2.4 仔猪抗体水平检测结果  36-37
      2.4.1 滴鼻+注射免疫的体液检测结果  36
      2.4.2 滴鼻免疫的体液检测结果  36
      2.4.3 不同免疫途径的体液检测  36-37
  3 讨论  37-38
结论  38-39
致谢  39-40
参考文献  40-44
作者简介  44-45
导师简介  45-46

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