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喜树内生真菌及其次级代谢产物的研究

作　者: 李霞
导　师: 刘佳佳
学　校: 中南大学
专　业: 制药工程
关键词: 喜树碱内生真菌响应面法培养基 SRAP
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

喜树碱作为特异性DNA拓扑异构酶抑制剂,是一种具有良好抗癌效果的有效成分。但是由于其在喜树植物中含量极低,提取困难,而且结构复杂,难以通过化学合成的方法得到。因此,植物内生真菌作为喜树碱新型的药用资源已引起了广泛的关注。本文从喜树树皮中共分离得到约50株内生真菌。以喜树碱标准品为对照,利用薄层色谱、紫外分光光度法以及高效液相色谱法,筛选出一株产喜树碱的内生菌株EFC I-13。通过形态学鉴定,将其归为青霉属。为了提高喜树碱的产量,对菌株EFC I-13的发酵培养基进行了优化。通过单因素实验选定的最佳碳源为葡萄糖,氮源为酵母膏和硫酸铵。Plackett-Burman实验表明影响喜树碱的主要因素为葡萄糖,磷酸二氢钾和L-色氨酸。最陡爬坡实验确定了这些主要因素的零点值。通过Box-Behnken实验和响应面分析,得到最佳发酵培养基为葡萄糖10.48g/L,磷酸二氢钾2.91g/L,L-色氨酸0.148g/L,酵母膏15g/L,硫酸镁0.5 g/L,硫酸铵0.8 g/L,氯化钙0.1 g/L,在此条件下喜树碱的最大产量为80.41μ/L。经过实验验证,在该培养基条件下,喜树碱产量达80.39μg/L,比优化培养基前的产量提高了43.9%。随机选择了36对PCR-SRAP引物对喜树内生真菌进行研究,筛选出了6对稳定性好,扩增条带多的引物组合。这6对引物组合共扩增出425条条带,其中365条为多态性条带,多态性条带的比例为85.9%。在相似系数为0.54时,菌株可分为三大类。说明了SRAP方法可用于喜树内生真菌的多态性分析。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第一章文献综述  8-20
  1.1 喜树概述  8-9
    1.1.1 喜树植物概述  8
    1.1.2 喜树化学成分  8-9
  1.2 内生真菌概述  9-13
    1.2.1 内生真菌的定义  9-10
    1.2.2 内生真菌的应用  10-11
    1.2.3 喜树内生真菌  11-13
  1.3 植物内生真菌次级代谢产物概述  13-17
    1.3.1 黄酮类化合物  13-14
    1.3.2 醌类化合物  14
    1.3.3 甾体类化合物  14-15
    1.3.4 萜类化合物  15
    1.3.5 生物碱类化合物  15-16
    1.3.6 其它类  16-17
  1.4 SRAP概述  17-19
    1.4.1 SRAP的原理及特点  17-18
    1.4.2 遗传多态性及亲缘关系研究  18
    1.4.3 种质资源鉴定评价  18
    1.4.4 遗传连锁图谱构建  18
    1.4.5 其它应用  18-19
  1.5 本课题研究背景及内容  19-20
第二章产喜树碱喜树内生真菌的筛选  20-33
  2.1 材料与仪器  20-21
    2.1.1 材料  20
    2.1.2 培养基  20
    2.1.3 试剂  20-21
    2.1.4 仪器  21
  2.2 内生真菌的分离纯化  21-22
    2.2.1 内生真菌的分离  21
    2.2.2 内生真菌的纯化  21-22
  2.3 内生真菌次级代谢产物提取  22
    2.3.3 内生真菌的培养  22
    2.3.4 内生真菌产物提取  22
  2.4 目标菌株的筛选  22-23
    2.4.1 薄层层析鉴定  22-23
    2.4.2 紫外分光光度检测  23
    2.4.3 高效液相色谱分析  23
  2.5 结果与讨论  23-29
    2.5.1 内生真菌的分离纯化结果  23
    2.5.2 薄层层析鉴定结果  23-26
    2.5.3 紫外分析结果  26-27
    2.5.4 高效液相分析结果  27-28
    2.5.5 讨论  28-29
  2.6 目标菌株的生物学特性  29-32
    2.6.1 目标菌株的培养  29
    2.6.2 显微形态特征的观察  29-30
    2.6.3 发酵特征的观察  30
    2.6.4 结果与讨论  30-32
  2.7 本章小结  32-33
第三章产喜树碱内生真菌发酵培养基的优化  33-46
  3.1 材料与仪器  33
    3.1.1 内生真菌  33
    3.1.2 培养基  33
    3.1.3 试剂  33
    3.1.4 仪器  33
  3.2 发酵培养基的优化  33-36
    3.2.1 碳源种类对喜树碱产量的影响  34-35
    3.2.2 氮源种类对喜树碱产量的影响  35
    3.2.3 Plackett-Burman实验设计  35
    3.2.4 最陡爬坡实验设计  35-36
    3.2.5 Box-Behnken实验设计  36
  3.3 结果与讨论  36-45
    3.3.1 碳源对喜树碱含量的影响  36-37
    3.3.2 氮源对喜树碱含量的影响  37-38
    3.3.3 Plackett-Burman实验设计结果  38-40
    3.3.4 最陡爬坡实验设计结果  40-41
    3.3.5 Box-Behnken实验结果  41-45
  3.4 本章小结  45-46
第四章喜树内生真菌的SRAP分析  46-57
  4.1 材料与仪器  46-47
    4.1.1 菌种  46
    4.1.2 培养基  46
    4.1.3 试剂  46-47
    4.1.4 仪器  47
    4.1.5 引物  47
  4.2 菌种培养及DNA提取  47-49
    4.2.1 菌种培养及提取方法  47-49
    4.2.2 菌株DNA提取与检测  49
  4.3 喜树内生真菌基因组SRAP-PCR扩增  49-50
    4.3.1 SRAP-PCR扩增条件  49-50
    4.3.2 SRAP-PCR扩增产物检测  50
  4.4 SRAP-PCR扩增数据分析  50-51
    4.4.1 SRAP反应引物筛选  50-51
    4.4.2 SRAP数据分析  51
  4.5 喜树内生真菌SRAP方法结果与讨论  51-56
    4.5.1 DNA提取检测  51
    4.5.2 SRAP多态性  51-52
    4.5.3 喜树内生真菌SRAP标记的遗传多样性分析  52-55
    4.5.4 讨论  55-56
  4.6 本章小结  56-57
第五章总结与展望  57-59
参考文献  59-67
致谢  67-68
攻读学位期间主要的研究成果及奖励  68

喜树内生真菌及其次级代谢产物的研究

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