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细粒棘球蚴细胞外信号调节激酶（EgERK1）基因的克隆、序列分析及功能的初步鉴定

作　者: 纪静
导　师: 买买提祖农·买苏尔
学　校: 新疆医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 细粒棘球蚴 ERK基因基因克隆序列分析功能鉴定
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:从细粒棘蚴(Echinococcus granulosus,Eg)中克隆细胞外信号调节激酶(EgERK1)基因,进行序列测定,生物信息学分析,构建pET28a-EgERK1原核表达质粒,经诱导、表达并纯化重组rEgERK1,Western Blot检测rEgERK1重组蛋白生物学特性,为进一步研究该基因在寄生虫与宿主相互作用中的功能奠定基础。方法:设计EgERK1基因特异性引物,从新疆株细粒棘球蚴中提取总RNA,RT-PCR法扩增EgERK1基因,构建pMD19-T/EgERK1质粒,测序确定序列并进行生物信息学分析。构建pET28a-EgERK1原核表达质粒,测序鉴定插入序列正确性。IPTG诱导表达rEgERK1-His重组蛋白,Ni-NTA His Bind Resin亲合层析柱纯化,SDS-PAGE法确定蛋白表达情况,Western Blot检测其生物学功能。结果:RT-PCR扩增出一条长度为1100bp的条带,测序结果显示其长度为1125bp,编码374个氨基酸,等电点为6.34,为一新基因,命名为EgERK1(EU701008)。同源性比较表明EgERK1与多房棘球绦虫EmMPK1基因同源性为95.45 %,与线虫、酵母、果蝇和人类等ERK基因的同源性为43.04～61.88 %。进化树分析结果发现EgERK1和多房击球绦虫ERK基因(EmMPK1)相聚集。功能分析预测EgERK1具有ERK类激酶T-X-Y结构保守区和酶激活功能域。成功构建了pET28a-EgERK1原核表达质粒,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测表明rEgERK1-His重组蛋白得到成功表达,在相对分子量47KDa处有表达条带;Western Blot分析显示rEgERK1-His重组蛋白能被特异性抗人ERK1/2单克隆抗体识别。结论:首次克隆细粒棘球蚴EgERK1新基因,成功构建高效融合表达基因工程菌株pET28a-EgERK1,成功诱导表达并纯化EgERK1重组蛋白,发现EgERK1重组蛋白具有与ERK1/2抗体结合的功能,为进一步研究该基因在寄生虫与宿主相互作用中的功能奠定基础。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-9
前言  9-12
材料与方法  12-25
  1. 材料  12-16
    1.1 质粒、菌种和细粒棘球蚴  12-13
    1.2 引物设计与合成  13
    1.3 试剂和酶  13
    1.4 实验中配制的主要试剂  13-15
    1.5 仪器设备  15-16
  2. 方法  16-25
    2.1 新疆细粒棘球蚴ERK1 基因的克隆及序列分析  16-19
    2.2 EgERK1 重组蛋白的诱导、表达、纯化及其抗原性的初步检测  19-25
结果  25-34
讨论  34-40
小结  40-41
致谢  41-42
参考文献  42-45
综述  45-52
攻读硕士学位期间发表的学术论文  52-53
导师评阅表  53

细粒棘球蚴细胞外信号调节激酶（EgERK1）基因的克隆、序列分析及功能的初步鉴定

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