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细粒棘球绦虫EgG1Y162抗原基因的序列分析及其蛋白表达

作　者: 曹春宝
导　师: 丁剑冰
学　校: 新疆医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 细粒棘球蚴 egG1Y162 序列分析原核表达重组蛋白
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:克隆egG1Y162抗原基因,构建PET-41a/egG1Y162原核表达质粒,并诱导表达egG1Y162重组蛋白及抗原性检测。方法:根据emY162基因序列设计引物,分别从细粒棘球绦虫原头蚴和成虫两个发育阶段,提取基因组DNA和总RNA,mRNA反转录为cDNA,利用PCR的方法以基因组DNA和cDNA为模板扩增egG1Y162基因;构建PUCm-T/egG1Y162重组质粒,经PCR、酶切及测序鉴定后,测序确定其正确性。利用定向克隆技术将egG1Y162抗原基因片段克隆至原核表达质粒PET-41a上,通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆,测序确定序列。IPTG初步诱导和表达egG1Y162-GST重组蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blot试验分析鉴定。结果:从细粒棘球绦虫的两个不同发育阶段均克隆出egG1Y162基因,从总DNA克隆得到片段长度1 680bp,从cDNA克隆得到片段长度459bp。相似性比较表明,egG1Y162基因序列与emY162相似性为91%,而egG1Y162基因cDNA与emY162相似性为95%。进一步分析显示,egG1Y162基因序列由3个外显子和2个内含子组成,外显子区域分别为1～70,1 064～1 380和1 577～1 648。位于疏水端1～16位氨基酸构成egG1Y162信号肽序列,35～115位氨基酸形成一个大的纤黏连蛋白剪接体FN3,133～152位氨基酸构成羧基端跨膜区域。测序结果显示egG1Y162抗原基因长度为360 bp,编码120个氨基酸。构建的PET-41a/egG1Y162原核表达质粒,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测表明egG1Y162-GST重组蛋白得到成功表达,在相对分子量为44 KDa处有表达条带。Western blot分析显示阳性印迹条带,分子量为44 KDa,egG1Y162重组蛋白能与细粒棘球蚴感染40天后犬的血清发生反应;与包虫病患者血清也有阳性反应。结论:成功克隆egG1Y162抗原基因,序列对比分析显示egG1Y162的cDNA与emY162的cDNA具有很高的相似性,基因的差异性主要存在于内含子区域,egG1Y162抗原基因是一种新的基因。成功诱导表达出egG1Y162重组蛋白,并且egG1Y162重组蛋白具有很好的抗原性。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
前言  10-11
试验一：细粒棘球蚴egG1Y162 抗原基因的克隆及序列分析  11-27
  1. 材料  11-13
  2. 方法  13-17
  3. 结果  17-25
  4. 讨论  25-27
试验二：细粒棘球蚴 egG1Y162 重组蛋白的诱导、表达、纯化及其抗原特性的研究  27-41
  1. 材料  27-30
  2. 方法  30-32
  3. 结果  32-39
  4. 讨论  39-41
小结  41-42
致谢  42-43
参考文献  43-48
附录  48-54
综述  54-64
攻读硕士学位期间科研论文  64-65
导师评阅表  65

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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