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重组蛋白GGH在毕赤酵母中高效表达及纯化

作　者: 杨涛
导　师: 许正宏
学　校: 江南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 融合蛋白GGH 毕赤酵母发酵工艺分离纯化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 135次
引　用: 4次
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内容摘要

GLP-1是由肠道L细胞合成和分泌的由30个氨基酸组成的多肽,它不仅能促进胰岛素合成,而且能够促进胰β细胞增殖和抑制胰β细胞凋亡。GLP-1独特的降血糖作用机制,是现有抗糖尿病药物无可比拟的,但由于其在体内的半衰期非常短,大大限制了其应用。为克服GLP-1半衰期短的缺点,实现其在体内的长效作用,本实验室成功构建了胰高糖素样多肽-1(GLP-1)突变串联体与人血清白蛋白的表达质粒pPIC9K/(GLP-1A2G)2-HSA,并且初步实现了在毕赤酵母KM71中的表达。在此基础上,本文主要围绕提高融合蛋白GGH的产量和分离纯化进行研究,主要结论如下:(1)统计分析了融合基因GGH在不同毕赤酵母宿主(KM71、GS115、SMD1168)中的表达,并通过荧光定量PCR研究了三株产量差异较大的GS115重组子基因剂量与融合蛋白GGH表达量的关系,实验结果表明:宿主GS115更有利于融合蛋白GGH的表达,融合蛋白的表达量与目的基因的剂量成正相关,最终确定高一株产菌株GS115/F2,在摇甁中的稳定表达量为328 mg/L。(2)研究了高表达菌株的发酵过程,确定了其在5 L发酵罐上的发酵工艺。实验结果表明有机氮源培养基更有利于融合蛋白GGH高密度表达及控制目的蛋白的降解;在有机氮源培养基中,0.5%的甲醇脉冲式流加方式和30℃诱导温度为最佳诱导条件,最终融合蛋白GGH的产量达到642 mg/L。(3)初步建立了融合蛋白GGH的分离纯化路线,即发酵液8000 r/min离心5 min, 10 kDa截留量的超滤膜超滤浓缩20倍, Blue Sepharose亲和吸附、Sephadex G25脱盐、Q Sepharose FF离子交换层析,整个纯化过程回收率为33.4%,经SDS-PAGE和HPLC检测纯度大于95%,符合下一步生物活性和药代动力学实验和药剂学试验的要求。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第一章绪论  8-16
  1.1 人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)概况  8-9
    1.1.1 人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)  8
    1.1.2 GLP-1 的生物学作用及临床作用  8
    1.1.3 GLP-1 长效类似物的研究进展  8-9
  1.2 人血清白蛋白的融合技术  9-10
    1.2.1 人血清白蛋白  9
    1.2.2 白蛋白融合技术  9-10
  1.3 毕赤酵母表达系统  10-12
    1.3.1 毕赤酵母（Pichia pastoris）  10
    1.3.2 毕赤酵母宿主菌及表达载体  10-11
    1.3.3 毕赤酵母表达系统对外源蛋白表达的影响  11-12
  1.4 毕赤酵母高密度发酵  12-13
    1.4.1 高密度发酵  12
    1.4.2 毕赤酵母补料分批发酵  12-13
  1.5 重组蛋白的分离纯化  13-14
    1.5.1 重组蛋白质的特性分离方法的选择  13-14
    1.5.2 重组蛋白分离纯化的特点  14
  1.6 本课题研究的意义和内容  14-16
    1.6.1 本课题研究的意义  14-15
    1.6.2 本课题的研究内容  15-16
第二章不同宿主及基因剂量对融合蛋白GGH 表达的影响  16-26
  2.1 引言  16
  2.2 材料与方法  16-22
    2.2.1 材料  16-19
    2.2.2 方法  19-22
  2.3 结果与分析  22-25
    2.3.1 重组质粒pPIC9K/GGH 的提取及其线性化  22
    2.3.2 融合基因GGH 在不同毕赤酵母表型中的表达及筛选  22-23
    2.3.3 高、中、低产菌株的发酵动力学参数比较  23
    2.3.4 荧光定量 PCR 确定高(GS115/F_2)、中(GS115/W_8)、低(GS115/I_2)产菌株拷贝数的差异  23-24
    2.3.5 Q-PCR 曲线和熔解度曲线  24-25
  2.4 本章小节  25-26
第三章诱导条件对高产重组子GS115/GGH表达的影响  26-38
  3.1 引言  26
  3.2 材料与方法  26-29
    3.2.1 培养基  26
    3.2.2 主要试剂  26-27
    3.2.3 主要仪器  27
    3.2.4 培养方法  27-28
    3.2.5 分析方法  28-29
  3.3 结果与讨论  29-36
    3.3.1 种子生长曲线  29-30
    3.3.2 5L 罐中无机氮源培养基与有机氮源培养基发酵过程分析  30-31
    3.3.3 不同的甲醇流加方式对GGH 表达量的影响  31-32
    3.3.4 不同的甲醇诱导浓度对GGH 表达量的影响  32-34
    3.3.5 不同的温度对GGH 表达量的影响  34-35
    3.3.6 优化条件下的 5 L 发酵罐表达 GGH  35-36
  3.4 本章小结  36-38
第四章融合蛋白GGH 的分离纯化  38-47
  4.1 引言  38
  4.2 材料与方法  38-40
    4.2.1 材料与试剂  38
    4.2.2 主要仪器  38-39
    4.2.3 分离纯化方法  39-40
    4.2.4 纯度检测方法  40
  4.3 结果与讨论  40-45
    4.3.1 融合蛋白GGH 的超滤浓缩过程  40-41
    4.3.2 Blue Sepharose 层析  41-42
    4.3.3 凝胶过滤层析  42
    4.3.4 融合蛋白GGH 的离子交换过程  42-44
    4.3.5 融合蛋白GGH 的脱盐  44
    4.3.6 融合蛋白GGH 纯化工艺总结  44
    4.3.7 融合蛋白GGH 的纯度鉴定  44-45
  4.4 本章小结  45-47
结论与展望  47-48
致谢  48-49
参考文献  49-53
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  53

重组蛋白GGH在毕赤酵母中高效表达及纯化

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