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人β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白的高产菌株筛选及制备工艺

作　者: 张琦
导　师: 金坚
学　校: 江南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: β干扰素融合蛋白毕赤酵母发酵纯化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 57次
引　用: 1次
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内容摘要

β干扰素具有抗病毒、抗增殖和免疫调节作用,广泛用于病毒性感染、恶性肿瘤、以及自身免疫性疾病的治疗或实验性治疗。但由于该药物前体在人体内半衰期较短,极大影响了其成药性,给临床应用带来很多的不便。针对以上问题,本研究室从构建融合蛋白的角度出发作出了一系列相关的工作。本文利用研究室已构建的IFNβ-HSA融合基因使其在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中得到了较高水平的表达,建立了一套实验室级的发酵、纯化工艺,达到了融合蛋白纯品批生产量200 mg的水平,为该融合蛋白药物的临床前研究奠定了基础。选用毕赤酵母GS115为宿主,利用营养缺陷型、抗生素G418和免疫斑点法的组合筛选得到的转化子产量高达180 mg/L。经Western Blot实验验证,表达出的融合蛋白在结构上符合我们的要求。经过对菌株的摇瓶表达条件优化,利用有机培养基,接种、培养至36 h后转入pH6.0、甲醇浓度2%、诱导浓缩比3:1的条件下诱导表达,可得到218 mg/L的表达量。在5 L发酵罐的放大试验中,当发酵至100 h时菌浓和产量均达到最高值,菌浓A600为350,表达量为500 mg/L。经过对于融合蛋白IFNβ-HSA的初步纯化条件的摸索,对其吸附、解吸附行为的规律有了进一步的了解。进而制定了新的纯化工艺,经过超滤浓缩、染料亲和层析、镍离子螯合亲和层析、阴离子交换层析几步分离得到了纯度大于95%的目的蛋白纯品,总回收率达到17%。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
第一章绪论  7-12
  1.1 β 干扰素的基因与结构  7-8
  1.2 β 干扰素的临床应用  8-10
    1.2.1 多发性硬化症  8
    1.2.2 人结肠癌和肺腺癌  8
    1.2.3 基底细胞癌  8
    1.2.4 抗寄生虫  8
    1.2.5 慢性乙、丙型肝炎  8-9
    1.2.6 SARS  9
    1.2.7 带状疱疹  9
    1.2.8 不良反应与预防  9-10
  1.3 β 干扰素应用上的局限性及改进  10-11
  1.4 立题背景及研究内容  11-12
第二章毕赤酵母融合蛋白 IFNβ-HSA 高产菌株的筛选  12-25
  2.1 材料  12-14
    2.1.1 仪器和设备  12
    2.1.2 主要试剂  12-13
    2.1.3 培养基  13-14
    2.1.4 质粒及菌株  14
  2.2 方法  14-19
    2.2.1 G418 抗性筛选高拷贝重组子  14-18
    2.2.2 免疫学方法筛选高表达重组子  18-19
  2.3 结果与讨论  19-24
    2.3.1 重组质粒pPIC9K-IFNβ-HSA 的富集  19-20
    2.3.2 SalⅠ酶切重组质粒pPIC9K-IFNβ-HSA  20
    2.3.3 线性化重组质粒pPIC9K-IFNβ-HSA 片段的纯化  20
    2.3.4 G418 抗性筛选出的菌株在摇瓶的表达情况  20-21
    2.3.5 应用免疫学方法筛选高表达转化子  21-23
    2.3.6 高表达菌株的获得  23-24
    2.3.7 Western Blot 鉴定融合蛋白  24
  2.4 小节  24-25
第三章融合蛋白 IFNβ-HSA 发酵工艺的建立  25-37
  3.1 材料  25-26
    3.1.1 仪器和设备  25-26
    3.1.2 主要试剂  26
    3.1.3 菌种  26
    3.1.4 培养基  26
  3.2 方法  26-30
    3.2.1 毕赤酵母摇瓶培养的生长和诱导情况  26-27
    3.2.2 摇瓶培养过程中甘油含量的测定  27
    3.2.3 毕赤酵母摇瓶表达IFNβ-HSA 单因素优化  27-28
    3.2.4 有机培养基上罐条件的建立  28
    3.2.5 双抗夹心法ELISA 测定融合蛋白IFNβ-HSA 表达量  28-29
    3.2.6 合成培养基上罐条件的探索  29-30
  3.3 结果与讨论  30-36
    3.3.1 毕赤酵母的生长曲线  30
    3.3.2 时间对毕赤酵母表达IFNβ-HSA 的影响  30
    3.3.3 诱导表达IFNβ-HSA 条件的单因素分析  30-31
    3.3.4 菌体生长对甲醇的耐受性  31
    3.3.5 高效液相色谱法测定摇瓶发酵液中的甘油  31-32
    3.3.6 罐上有机培养基发酵毕赤酵母的生长及表达情况  32-33
    3.3.7 罐上合成培养基发酵毕赤酵母的生长及表达情况  33-36
  3.4 小节  36-37
第四章融合蛋白 IFNβ-HSA 纯化工艺的建立  37-48
  4.1 材料  37-38
    4.1.1 仪器和设备  37
    4.1.2 层析填料  37-38
  4.2 方法  38-40
    4.2.1 初步纯化条件的摸索  38-39
    4.2.2 改进的蛋白纯化路线  39
    4.2.3 HPLC 检测融合蛋白纯度  39
    4.2.4 细胞病变抑制法测定融合蛋白活性  39-40
  4.3 结果与讨论  40-47
    4.3.1 乙醇沉淀IFNβ-HSA 的效果  40
    4.3.2 超滤浓缩脱盐  40
    4.3.3 利用超滤分级去除色素  40-41
    4.3.4 阳离子交换层析结果  41
    4.3.5 镍离子螯合亲和层析结果  41-42
    4.3.6 阴离子交换层析结果  42
    4.3.7 凝胶过滤层析结果  42-43
    4.3.8 改进纯化路线后的分离纯化效果  43-44
    4.3.9 融合蛋白的Western Blotting 鉴定  44-45
    4.3.10 HPLC 检测融合蛋白纯度  45
    4.3.11 融合蛋白的生物活性  45-47
  4.4 小节  47-48
第五章论文总结  48-49
  5.1 主要结论  48
  5.2 存在的问题与展望  48-49
致谢  49-50
参考文献  50-54
已发表的文章  54

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