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苏云金芽孢杆菌BRC-LLP29菌株cyt2B基因的克隆、表达及杀蚊活性测定

作　者: 张琪
导　师: 关雄
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 苏云金芽孢杆菌 Cyt2B蛋白克隆表达杀蚊活性
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 57次
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内容摘要

Cyt蛋白是由苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis.subsp. israelensis,Bti)在芽形成孢阶段产生的δ-内毒素组成。本研究根据己报道在NCBI上的cyt2B基因序列,设计特异引物对Bt LLP29菌株中总DNA进行PCR扩增,得到大小约为1,000bp的类似cyt2B基因,对该基因进行克隆、表达,确定了菌株中cyt2B基因的存在,以pGEX-KG为表达载体构建cyt2B基因的表达重组质粒,并对其杀蚊活性进行测定,从而试图探索Cyt2B蛋白的生物活性及其在菌株中的生物功能。结果表明,经PCR扩增、克隆、测序,获得序列大小约为1,000bp的基因全序列,序列里包含两个ORF,大小分别为789 bp和117 bp,其中789bp编码约为262个氨基酸,与文献中Cyt2B蛋白的氨基酸大小一致。利用NCBI上的Blast在线软件进行比较,发现10个Bt cyt2B基因序列以及多个基因组片段,其中与己报道的cyt2Ba7,cyt2Ba8等5个基因全序列(包括原始基因片段)同源性达到98%。因此,判断克隆出来的基因序列为cyt2B基因。经SDS-PAGE验证诱导表达重组菌株,显示该蛋白大小约为30kD,确定该基因编码的蛋白为Cyt2B。取Cyt2B蛋白表达重组菌株对白蚊伊蚊和致倦库蚊进行毒性测试,与Bt LLP29菌株相比,该表达菌株并不显示杀蚊活性。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-9
引言  9-16
  1 苏云金芽孢杆菌概述  10-11
    1.1 Bt 杀虫蛋白  10
    1.2 VIP 杀虫蛋白  10-11
    1.3 ICPs 基因蛋白  11
    1.4 ICPs 蛋白晶体的作用机制  11
  2 Cry 蛋白  11-12
    2.1 Cry 蛋白的结构  11-12
    2.2 Cry 蛋白的应用  12
  3 Cyt 蛋白研究  12-14
    3.1 Cyt 蛋白概述  12-13
    3.2 Cyt 蛋白的分布和分类  13
    3.3 Cyt 蛋白的结构  13
    3.4 Cyt 蛋白的研究进展  13-14
    3.5 Cyt 蛋白作用机制的研究  14
  4 Bt 杀蚊研究  14-15
  5 本研究的目的及意义  15-16
材料与方法  16-29
  1 材料  16-18
    1.1 供试菌株  16
    1.2 质粒载体  16
    1.3 酶与试剂  16-17
    1.4 培养基  17-18
  2 方法  18-29
    2.1 菌株培养  18
    2.2 Bt 基因组DNA 的提取  18
    2.3 cyt2B 基因的克隆  18-22
    2.4 cyt2B 基因的原核表达  22-29
结果与分析  29-36
  1 cyt2B 基因的克隆及序列分析  29-32
    1.1 PCR 扩增及克隆重组质粒的鉴定  29-30
    1.2 序列测定  30
    1.3 生物信息学序列分析  30-32
  2 原核表达  32-35
    2.1 原核表达载体的构建  32-33
    2.2 原核表达载体的PCR 及酶切鉴定  33-34
    2.3 目的蛋白诱导表达  34-35
  3 Cyt2B 表达蛋白杀虫活性的测定  35-36
讨论  36-38
参考文献  38-47
致谢  47

苏云金芽孢杆菌BRC-LLP29菌株cyt2B基因的克隆、表达及杀蚊活性测定

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