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鸟氨酸生产菌种选育

作　者: 张骁
导　师: 张鹏
学　校: 北京化工大学
专　业: 轻工技术与工程
关键词: L-鸟氨酸 L-精氨酸苏云金芽孢杆菌酶法固定化细胞
分类号: TQ922
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

L-鸟氨酸存在于生物体多种组织和细胞中,在生物体代谢中起到重要作用。它是尿素生成的中间产物,是精氨酸、瓜氨酸等多种氨基酸代谢的前体物质,主要参与产尿素的鸟氨酸循环中,对体内集聚的氨具有解毒作用。L-鸟氨酸主要用于制备保肝、护肝、治疗肝病、抗疲劳、抗虚弱等各种复方氨基酸输液。目前制备L-鸟氨酸的方法主要有提取法,化学法,微生物发酵法和酶法。酶法是利用动植物或微生物体内的精氨酸酶作催化剂,水解精氨酸,生成鸟氨酸和尿素。本文研究了鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷型菌株的筛选,固定化苏云金芽孢杆菌细胞转化L-鸟氨酸的方法以及L-鸟氨酸与牛血清白蛋白相互作用的光谱学性质,目的在于寻找成本低廉,工艺简洁,质量可靠的L-鸟氨酸生产路线,为今后L-鸟氨酸的工业化生产奠定基础。本实验利用实验室保藏的一株苏云金芽孢杆菌进行诱变,确定了培养基中的无机氮源采用乙酸铵,其浓度为0.9%,复合诱变处理中的硫酸二乙酯处理时间为5min,紫外照射时间为1min。采用PVA与卡拉胶对菌体细胞进行固定化,确定了PVA浓度为5%,卡拉胶浓度为2.5%,固定化9h后所得的固定化细胞操作稳定性较高,可反复利用7次而L-鸟氨酸产量基本不变。同时确定了在摇床中固定化细胞转化制备L-鸟氨酸的最适条件：温度30℃、pH 10.0、转化时间24h、L-精氨酸浓度100g·L-1,得到的L-鸟氨酸浓度最高为31.04g.L-1,是游离细胞产量的71.24%。通过对L-鸟氨酸与牛血清白蛋白作用的光谱学研究,发现L-鸟氨酸能够使牛血清白蛋白发生淬灭,其机理为静态淬灭。在生理条件下的淬灭常数KSV为296.2L.mol-1,速率常数Kq为2.962×1010L.mo1-1·s-1,结合位点数n为0.96319,结合常数KA为227.9L.mol-1。两者的结合能力不强且pH对其结合能力的影响较大。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章绪论  12-26
  1.1 引言  12-13
  1.2 L-鸟氨酸的性质  13
  1.3 L-鸟氨酸的应用  13-14
  1.4 L-鸟氨酸的生产方法  14-17
    1.4.1 化学法  14-16
      1.4.1.1 有机合成法  14-15
      1.4.1.2 精氨酸水解法  15-16
    1.4.2 提取法  16
    1.4.3 酶法  16-17
    1.4.4 发酵法  17
  1.5 L-鸟氨酸的检测方法  17-20
    1.5.1 纸层析法和薄层层析法  18-19
    1.5.2 HPLC柱前衍生法  19
    1.5.3 酶法分析  19
    1.5.4 分光光度法  19
    1.5.5 氨基酸分析仪法  19-20
  1.6 固定化细胞技术  20-24
    1.6.1 概述  20
    1.6.2 固定化细胞的制备方法  20-22
      1.6.2.1 吸附法  20-21
      1.6.2.2 交联法  21
      1.6.2.3 包埋法  21
      1.6.2.4 多孔物质包络法  21-22
      1.6.2.5 共价结合法  22
      1.6.2.6 超过滤法  22
    1.6.3 常用固定化方法的优缺点  22-23
    1.6.4 固定化细胞的载体  23-24
      1.6.4.1 无机材料  23
      1.6.4.2 有机高分子材料  23-24
      1.6.4.3 复合材料  24
  1.7 本论文的研究目的与内容  24-26
第二章 L-鸟氨酸高产菌株的筛选  26-36
  2.1 引言  26
  2.2 实验原理  26-27
  2.3 实验方法  27-31
    2.3.1 培养基组成  27
    2.3.2 育种方法  27-29
      2.3.2.1 紫外诱变  27-28
      2.3.2.2 化学诱变  28
      2.3.2.3 复合诱变  28-29
    2.3.3 影印平板法  29
    2.3.4 L-鸟氨酸的检测方法  29-31
      2.3.4.1 L-鸟氨酸的定性检测  29-30
      2.3.4.2 L-鸟氨酸的定量检测  30-31
    2.3.5 生物量的检测方法  31
  2.4 实验结果  31-34
    2.4.1 无机氮源对苏云金芽孢杆菌生长的影响  31
    2.4.2 乙酸铵浓度对菌体生长的影响  31-32
    2.4.3 紫外照射时间的确定  32-33
    2.4.4 硫酸二乙酯处理时间的确定  33
    2.4.5 复合诱变处理时间的确定  33-34
    2.4.6 营养缺陷型菌株的筛选结果  34
  2.5 本章小结  34-36
第三章固定化细胞转化制备L-鸟氨酸  36-53
  3.1 引言  36
  3.2 实验方法  36-39
    3.2.1 菌种的培养  36-37
      3.2.1.1 实验菌种  36
      3.2.1.2 培养基组成  36
      3.2.1.3 菌种的制备条件  36-37
    3.2.2 不同载体的固定化方法  37-38
      3.2.2.1 PVA包埋法  37
      3.2.2.2 海藻酸钠包埋法  37
      3.2.2.3 卡拉胶包埋法  37
      3.2.2.4 琼脂包埋法  37-38
      3.2.2.5 树脂吸附法  38
      3.2.2.6 PVA+海藻酸钠包埋法  38
      3.2.2.7 PVA+卡拉胶包埋法  38
      3.2.2.8 黄蓍胶包埋法  38
    3.2.3 固定化细胞强度的检测  38-39
    3.2.4 固定化细胞传质性能的检测  39
    3.2.5 转化液中L-鸟氨酸含量的测定  39
    3.2.6 转化液中游离菌体量的测定  39
  3.3 实验结果  39-52
    3.3.1 不同载体的固定化结果  39-41
      3.3.1.1 PVA包埋法  39-40
      3.3.1.2 海藻酸钠包埋法  40
      3.3.1.3 卡拉胶包埋法  40
      3.3.1.4 琼脂包埋法  40
      3.3.1.5 树脂吸附法  40
      3.3.1.6 PVA+海藻酸钠包埋法  40-41
      3.3.1.7 PVA+卡拉胶包埋法  41
      3.3.1.8 黄蓍胶包埋法  41
      3.3.1.9 固定化方法的确定  41
    3.3.2 PVA与卡拉胶浓度的确定  41-43
    3.3.3 固定化时间的确定  43-44
    3.3.4 L-精氨酸添加量的确定  44-46
    3.3.5 硼酸与KCl浓度的确定  46-47
    3.3.6 固定化细胞的量对L-鸟氨酸产量的影响  47-49
    3.3.7 温度对固定化细胞酶活的影响  49-50
    3.3.8 pH对固定化细胞酶活的影响  50-51
    3.3.9 转化时间对L-鸟氨酸产量的影响  51
    3.3.10 固定化细胞转化批次的确定  51-52
  3.4 本章小结  52-53
第四章 L-鸟氨酸与牛血清蛋白相互作用的光谱研究  53-61
  4.1 引言  53
  4.2 实验方法  53-54
    4.2.1 试剂的配制  53
    4.2.2 荧光光谱的测定方法  53-54
    4.2.3 紫外光谱的测定方法  54
  4.3 实验结果  54-60
    4.3.1 荧光光谱的变化  54-56
    4.3.2 淬灭机理的判断  56-57
    4.3.3 结合位点数n及结合常数K_A的进一步计算  57-59
    4.3.4 紫外吸收光谱的变化  59-60
  4.4 本章小结  60-61
第五章结论与建议  61-62
  5.1 结论  61
  5.2 建议  61-62
参考文献  62-67
附录1 实验仪器  67-68
附录2 实验试剂及药品  68-70
致谢  70-71
研究成果及发表的学术论文  71-72
作者简介  72
导师简介  72

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