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ABA诱导的水稻叶片中OsHsfs基因的克隆与表达分析

作　者: 党姣
导　师: 蒋明义
学　校: 南京农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: ABA H2O2 热激转录因子 载体构建
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 86次
引　用: 1次
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内容摘要


植物激素脱落酸(abscisic acid,ABA)可以参与调节植物抗逆境(包括干旱、冷害、盐害等)的多种生理反应。近年来,植物激素ABA作为重要信号分子的研究越来越深入广泛。已有研究表明ABA的作用模式与植物细胞中氧化胁迫有关,ABA能够诱导NADPH氧化酶引起活性氧产生及抗氧化基因的表达,从而提高植物抗氧化防护能力。植物热激转录因子(heat shock transcription factors, Hsfs)作为植物热激反应时的主要调控因子,在植物热激胁迫下的研究已经非常丰富深入。除了热激反应外,热激转录因子还参与了植物其他非生物胁迫如干旱和氧化等胁迫的反应过程,并通过调节胁迫基因的表达而提高植物氧化胁迫耐性。但是关于ABA诱导的氧化胁迫信号途径与植物热激转录因子Hsfs基因关系方面的研究尚未见报道。为此,本实验以水稻为研究对象,利用生物信息学和分子生物学相结合的方法,以半定量RT-PCR为主要研究手段对水稻中两条OsHsfs基因OsHsfA4a和OsHsfA2与ABA和H2O2的关系进行了研究。主要结果如下：采用半定量RT-PCR方法,100μmol·L-1ABA处理后,水稻OsHsfA4a和OsHsfA2基因的转录水平和对照相比,分别在4 h处理时间内的30 min和180 min产生两个上调表达高峰；10m mol·L-1 H2O2处理后,水稻OsHsfA4a和OsHsfA2基因的转录水平和对照相比,分别在4 h处理时间内的15 min和120 min产生两个上调表达高峰；H2O2清除剂DMTU、CAT和抑制剂DPI预处理后的样品较对照样品,所有时间点OsHsfs基因表达情况和对照近乎相同,说明预处理后的ABA处理没有诱导水稻OsHsfs基因表达增强。H202清除剂预处理后ABA诱导产生的H2O2被有效清除了,ABA不能诱导水稻OsHsfs基因表达增强。证明了ABA诱导水稻OsHsfs基因表达增强是通过ABA诱导产生的内源H202来起作用的。这些结果初步阐明了在ABA信号途径中ABA、H2O2与植物热激转录因子三者之间的关系,从而为ABA诱导植物细胞抗氧化防护系统的信号转导途径提供了新的证据。原生质体瞬间表达系统以游离分散的植物细胞和原生质体为研究对象,借助物理或化学方法将外源DNA直接导入植物细胞,使DNA进入植物细胞核,并在短期内能够检测到基因表达产物—新蛋白质的合成和酶的活性.至今原生质体瞬间表达系统已经广泛应用于诸如不同的调控顺序和基因功能,植物激素、紫外光、热激、厌氧条件、代谢产物等各种内外因素对基因表达影响的研究。本实验通过分子生物学方法克隆了两条受ABA诱导的OsHsfs基因OsHsfA4a和OsHsfA2的全长ORF序列,进一步成功构建了含有目的基因和以黄色荧光蛋白(yellow fluorescent proteins, YFP)为报告基因的重组原生质体瞬间表达载体,为以后水稻原生质体瞬间表达体系转化等工作做准备,为进一步研究ABA诱导的OsHsfs在水稻原生质体瞬间表达体系中的亚细胞定位以及ABA诱导的OsHsfs基因表达与ABA诱导的抗氧化防护基因如：Sod4, Cat1及Apx1等表达的关系做准备,为深入了解和丰富ABA信号转导途径网络关系图奠定基础

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
中英文对照缩略语表  10-12
第一章 文献综述  12-26
  1 ABA  12-15
    1.1 ABA信号转导研究进展  12-14
    1.2 ABA在植物细胞抗氧化防护中的作用  14-15
  2 ROS在ABA信号转导中的信号作用  15-18
    2.1 ROS概述  15
    2.2 ABA诱导ROS的产生  15
    2.3 ROS在ABA信号转导中的作用  15-18
  3 植物Hsfs研究进展  18-23
    3.1 Hsfs结构  18-19
    3.2 Hsfs活化过程  19-20
    3.3 热激胁迫下的Hsfs  20-22
    3.4 其他非生物胁迫下的Hsfs  22-23
  4 本研究的目的和意义  23-24
  5 本实验研究思路与方法  24-26
第二章 ABA诱导的水稻叶片中OsHsfs基因的表达分析  26-36
  1 材料与方法  27-30
    1.1 实验材料  27-28
    1.2 引物设计  28
    1.3 水稻总RNA提取  28-30
    1.4 RNA纯度检测  30
    1.5 cDNA第一链的合成  30
    1.6 PCR扩增目的基因  30
  2 结果与分析  30-34
    2.1 不同浓度ABA对水稻OsHsfs基因表达的影响  30-31
    2.2 ABA诱导上调水稻OsHsfs基因表达  31-32
    2.3 不同浓度H_2O_2对水稻OsHsfs基因表达的影响  32
    2.4 H_2O_2诱导上调水稻OsHsfs基因表达  32-33
    2.5 H_2O_2清除剂和抑制剂对水稻OsHsfs基因表达的影响  33
    2.6 ABA通过内源H_2O_2调节水稻OsHsfs基因表达  33-34
  3 讨论  34-36
第三章 ABA诱导的OsHsfs基因克隆及原生质体瞬间表达载体构建  36-44
  1 材料和方法  37-41
    1.1 实验材料  37
    1.2 引物的设计  37
    1.3 植物总RNA提取  37
    1.4 RNA纯度检测  37-38
    1.5 cDNA第一链合成  38
    1.6 PCR扩增目的基因  38
    1.7 目的基因回收纯化  38-39
    1.8 目的基因连接T载体  39
    1.9 连接产物转化  39-40
    1.10 转化克隆的筛选及鉴定  40
    1.11 重组载体序列测定和分析  40
    1.12 碱裂法小量法提质粒  40
    1.13 质粒双酶切  40-41
    1.14 目的基因连接原生质体瞬间表达载体  41
    1.15 连接产物转化  41
    1.16 重组原生质体瞬间表达载体序列测定和分析  41
  2 结果与分析  41-42
    2.1 全长目的基因的克隆  41
    2.2 重组原生质体瞬间表达载体的构建及鉴定  41-42
  3 讨论  42-44
参考文献  44-50
全文结论  50-51
攻读学位期间发表与投送的论文  51-52
附录  52-62
致谢  62

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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