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磷脂酶Dα1和Ca²⁺在拟南芥气孔关闭中的相互关系研究

作　者: 肖云
导　师: 章文华
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物学
关键词: Ca2+ ABA H2O2 EGTA LaCl3 磷脂酶Dα1 磷脂酸气孔保卫细胞
分类号: Q946
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文以Columbia生态型拟南芥(野生型)和由T-DNA插入法获得的PLDal敲除突变体(pldal)为实验材料,选用保卫细胞为研究体系,采用药理学、生理学、细胞生物学等方法系统地研究了拟南芥中磷脂酶Dal、磷脂酸(PA)、H2O2、Ca2+在ABA介导的气孔运动过程中的作用及其相互关系。研究结果表明NaCl和ABA能诱导WT的气孔关闭,对pldal没有显著作用,EGTA能抑制或减少ABA引起的气孔关闭；PLDal的产物PA(di18:1 PA和di16:0-18:2 PA)以及溶血磷脂酸(Lyso PA)均能促进WT和pldal气孔关闭,EGTA不同程度抑制或减少不同分子种PA引起的气孔关闭；H202能诱导WT和pldal气孔关闭,且这种作用呈现浓度依赖性。对于WT,当[H2O2]≤10-5 mol·L-1, EGTA可以抑制H202引起的气孔关闭过程；对于pldal,当[H2O2]≤10-4 mol·L-1, EGTA可以抑制H202诱导的气孔关闭过程；外源Ca2+和LaCl3也均能诱导WT和pldal的关闭。这些结果说明PLDal参与了NaCl和ABA诱导的气孔关闭过程,且有可能作用于二者的下游；保卫细胞内源Ca2+有可能参与了ABA、PA、H2O2诱导的气孔关闭过程；此外,外源Ca2+可以通过质膜上的通道进入胞质内,引起气孔的关闭,而La3+引起气孔关闭的作用机制可能与其作用于膜系统上Ca2+和K+in通道有关。在拟南芥表皮中装载钙离子荧光指示剂Fluo-3 AM,利用激光共聚焦技术检测了Ca2+、NaCl、ABA、PA和H202对保卫细胞内Ca2+浓度的影响。结果发现50 mM NaCl和10μMABA能诱导WT保卫细胞中Ca2+浓度迅速升高,而pldal, Ca2+浓度上升比较缓慢,且水平明显低于野生型,表明：PLDα1蛋白的缺失,严重影响了保卫细胞中Ca2+对ABA信号的反应。50μM不同分子种PA,1000μM H2O2和0.01、0.1、1、10 mM CaCl2均能诱导WT和pldal保卫细胞Ca2+浓度的升高,但是WT反应更快,Ca2+达到峰值的浓度也明显高于pldal。表明：在拟南芥保卫细胞中,外源NaCl、ABA能促进Ca2+浓度升高,升高的Ca2+又激活PLDα1,产生信号分子PA, PA可能与相应的靶蛋白结合,诱导Ca2+浓度的升高。我们的研究还表明PLDal可能通过PA提高拟南芥耐盐性,Ca2+部分参与了这个过程。当NaCl浓度升至200 mmol·L-1时,外施PA,WT存活率上升,而pldal存活率反而下降,说明较高盐浓度下,PLDal的缺失严重影响了拟南芥幼苗的耐盐性,即使外源PA也无法缓解幼苗的死亡；在EGTA存在下,外施PA,WT和pldal都无法存活,表明植物面对较高浓度的盐胁迫时,细胞内会自主调节Ca2+稳态,而一旦这种状态被打破,则耐盐性大大降低,进一步证明了Ca2+可能介导了PA调控的拟南芥对盐胁迫的响应。当采用200 mM NaCl和100.200μM LaCl3处理4天后发现：WT和pldal幼苗存活率大大降低,且这种抑制效应随着La3+浓度的升高而加重,即使外施50μM PA也基本不能提高耐盐性,说明La3+可能通过抑制Ca2+进入细胞进而抑制了PA对盐胁迫的响应调控作用。不同的药理学试验均表明Ca2+可能介导了PA调控的拟南芥对盐胁迫的响应。

全文目录

摘要 7-9ABSTRACT 9-11符号及缩略语表 11-12第一章文献综述 12-34 第一节 ABA在植物生长发育和响应胁迫中的作用 12-17 1 ABA的合成 12-13 2 ABA受体 13 3 ABA在植物生长发育中的作用和对胁迫条件的响应 13-14 3.1 ABA在植物生长、发育中的作用 13 3.2 ABA对环境胁迫的响应 13-14 4 ABA调控气孔运动 14-16 4.1 Ca~(2+) 14-15 4.2 H_2O_2 15-16 4.3 PLD 16 4.4 NO 16 5 结束语 16-17 第二节磷脂酶D和磷脂酸在植物细胞中的作用 17-22 1 PLD和PA在植物生长发育过程中的作用 17-19 1.1 PLD参与气孔运动 17-18 1.2 PLD和PA参与根毛生长 18 1.3 PLD和PA参与花粉管伸长 18 1.4 PLD介导微管重组 18-19 2 PLD和PA参与非生物胁迫过程 19-20 3 PLD与Ca~(2+)的关系 20-21 4 结束语 21-22 第三节钙离子——植物细胞内的第二信使 22-34 1 植物细胞钙离子动态平衡及其调控机制 22-24 1.1 细胞内Ca~(2+)分布 22 1.2 Ca~(2+)进入细胞质 22-23 1.3 Ca~(2+)流出细胞质 23-24 2 植物细胞钙信号的特异性 24-25 2.1 时间特异性 24-25 2.2 空间特异性 25 3 植物细胞Ca~(2+)信号的靶蛋白 25-28 3.1 钙调素(CaM) 26 3.2 钙依赖的蛋白激酶(CDPK) 26-27 3.3 钙离子调节的磷酸酶 27-28 4 保卫细胞钙信号 28-30 4.1 保卫细胞中调控[Ca~(2+)]_(cyt)的信号物质 28-29 4.2 [Ca~(2+)]_(cyt)增加的上游信号 29-30 4.3 [Ca~(2+)]_(cyt)增加的下游分子:磷酸化和去磷酸化 30 5 细胞内游离钙离子测定方法 30-33 5.1 钙离子荧光指示剂的种类 30-32 5.2 Cameleon 32 5.3 膜片钳 32-33 6 结束语 33-34第二章 Ca~(2+)和PLDα1在ABA介导的拟南芥气孔关闭中的作用 34-45 引言 34-35 1 材料与方法 35-36 1.1 实验材料 35 1.2 材料的培养 35-36 1.3 气孔开度的测定 36 1.4 数据处理与图表绘制 36 2 结果与分析 36-42 2.1 盐处理对气孔开度的影响 36-37 2.2 ABA处理对气孔开度的影响 37-38 2.3 不同分子种磷脂酸(PA)处理对气孔开度的影响 38-39 2.4 H_2O_2处理对气孔开度的影响 39-41 2.5 CaCl_2处理对气孔开度的影响 41-42 2.6 Ca~(2+)通道无机抑制剂(LaCl_3)处理对气孔开度的影响 42 3 讨论 42-45第三章 ABA、磷脂酸和H_2O_2对拟南芥保卫细胞内Ca~(2+)浓度的影响 45-56 引言 45-46 1 材料与方法 46-47 1.1 实验材料 46 1.2 材料的培养 46 1.3 Ca~(2+)的荧光染料(Fluo-3)的染色 46 1.4 保卫细胞内Ca~(2+)的激光共聚焦测定 46-47 1.5 数据处理与图表绘制 47 2 结果与分析 47-54 2.1 盐处理对保卫细胞中[Ca~(2+)]_(cyt)的影响 47-48 2.2 ABA处理对保卫细胞中[Ca~(2+)]_(cyt)的影响 48-51 2.3 不同分子种PA对保卫细胞中[Ca~(2+)]_(cyt)的影响 51-52 2.4 H_2O_2处理对保卫细胞中[Ca~(2+)]_(cyt)的影响 52-53 2.5 CaCl_2处理对保卫细胞中[Ca~(2+)]_(cyt)的影响 53-54 3 讨论 54-56第四章磷脂酶Dα1在盐胁迫中的作用及其与Ca~(2+)的关系 56-64 引言 56-57 1 材料与方法 57-58 1.1 实验材料 57 1.2 材料的培养 57 1.3 MS培养基培养幼苗及处理 57 1.4 幼苗存活率测定 57-58 1.5 数据处理与图表绘制 58 2 结果与分析 58-61 2.1 盐胁迫以及PA和EGTA处理对幼苗生长的影响 58-60 2.2 LaCl_3处理对幼苗生长的影响 60-61 3 讨论 61-64全文结论 64-66创新之处 66-68参考文献 68-78致谢 78

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