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非洲爪蟾眼发育和晶状体再生过程中Pax6基因表达荧光定量PCR和免疫组化分析

作　者: 朱利瑞
导　师: 高岚
学　校: 兰州大学
专　业: 动物学
关键词: 非洲爪蟾 发育 再生 Real-Time PCR 免疫组化 Pax6基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 115次
引　用: 3次
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内容摘要


以无尾两栖类(Anuran)非洲爪蟾(Xenopus Laevis)胚胎及后肢芽期蝌蚪为实验材料,采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)法,SP免疫组织化学法分别测定非洲爪蟾胚胎期眼睛发育过程中及后肢芽期蝌蚪晶状体再生过程中Pax6的表达。免疫组化结果显示:非洲爪蟾蝌蚪晶状体再生来源于外角膜的内层细胞;与对照组相比,晶状体再生过程中Pax6蛋白在眼睛、角膜及晶状体中的表达有明显的变化;随着晶状体再生,外角膜Pax6蛋白表达由高到低,最后趋于稳定;随着晶状体再生,晶状体内Pax6蛋白由整个晶状体表达,最后仅晶状体上皮表达Pax6蛋白;Pax6蛋白表达免疫组化光密度分析结果显示,晶状体摘除后第1天,Pax6蛋白在外角膜中的表达量即显著升高,Pax6蛋白累积光密度与对照组相比达到极显著水平(P＜0.01);在晶状体再生过程中Pax6蛋白存在两个明显的表达高峰,晶状体再生第3天、7天。Pax6蛋白累积光密度测量结果显示,晶状体再生第3天累积光密度值是Pax6在眼睛内表达的第一个高峰,与再生第1天、5天相比,达到显著水平(0.01＜P＜0.05);再生第7天眼睛内Pax6蛋白表达累积光密度值是Pax6在眼睛内表达的第二个高峰,与再生第5天、9天相比,达到显著水平(0.01＜P＜0.05)。荧光定量PCR结果显示:在非洲爪蟾眼睛发育及晶状体再生过程中Pax6基因mRNA分别存在两个明显的表达高峰,它们是胚胎20期、34期,晶状体再生第3天、7天。以上研究结果表明,Pax6基因在非洲爪蟾眼睛发育和晶状体再生过程中发挥晶状体诱导、调控细胞增殖和晶状体纤维分化的作用;为进一步研究脊椎动物眼睛发育及晶状体再生的分子机制奠定了基础。

全文目录


中文摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
前言  9-28
  1.1 眼睛的结构和作用  9-10
    1.1.1 眼球的组成  9
    1.1.2 角膜、脉络膜、睫状体、视网膜的功能  9-10
  1.2 晶状体的结构和作用  10-11
  1.3 眼睛发育和晶状体诱导  11-13
  1.4 晶状体再生和去分化、转分化过程  13-15
  1.5 眼睛发育和晶状体再生过程中涉及的主要基因  15-21
    1.5.1 Pax6  16-17
    1.5.2 Sox  17-18
    1.5.3 Maf  18-19
    1.5.4 Prox1  19
    1.5.5 其他转录因子  19-21
  1.6 实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)  21-23
    1.6.1 荧光染料嵌合法(SYBR Green Ⅰ)定量作用机理  21-22
    1.6.2 内参基因的选择  22-23
  1.7 免疫组织化学技术  23-24
  1.8 实验动物简介  24-28
    1.8.1 非洲爪蟾(Xenopus laevis)简介  24-25
    1.8.2 非洲爪蟾胚胎发育主要时期简要描述  25-28
材料与方法  28-34
  2.1 实验材料  28-29
    2.1.1 实验取材  28
      2.1.1.1 胚胎发育不同期数取材  28
      2.1.1.2 晶状体再生不同天数取材  28
    2.1.2 药品与试剂  28
    2.1.3 引物  28-29
  2.2 实验方法  29-34
    2.2.1 晶状体摘除  29
    2.2.2 荧光定量PCR法测定Pax6基因在眼睛发育和晶状体再生过程中的表达  29-32
      2.2.2.1 RNA的提取  29
      2.2.2.2 Real-Time之反转录  29-30
      2.2.2.3 引物扩增效果预实验  30-31
      2.2.2.4 制作标准曲线  31
      2.2.2.5 Real-Time PCR  31-32
    2.2.3 免疫组织化学分析  32-34
      2.2.3.1 免疫组织化学染色步骤  32-33
      2.2.3.2 免疫组织化学结果分析  33-34
结果  34-42
  3.1 Real-Time PCR  34-38
    3.1.1 RNA提取电泳图  34
    3.1.2 引物扩增效果预实验电泳图  34
    3.1.3 标准曲线  34-35
    3.1.4 荧光定量结果  35-38
      3.1.4.1 非洲爪蟾胚胎正常发育Pax6基因荧光定量结果  35-37
      3.1.4.2 非洲爪蟾晶状体再生过程中Pax6基因表达荧光定量结果  37-38
  3.2 免疫组织化学结果  38-42
    3.2.1 非洲爪蟾晶状体再生过程中Pax6蛋白表达免疫组织化学观察  38-40
    3.2.2 非洲爪蟾晶状体再生不同天数Pax6蛋白表达免疫组织化学平均光密度与累积光密度测量结果  40-42
      3.2.2.1 晶状体再生过程中眼睛Pax6蛋白表达平均光密度与累积光密度测量结果  40
      3.2.2.2 晶状体再生过程中外角膜Pax6蛋白表达平均光密度与累积光密度测量结果  40-41
      3.2.2.3 晶状体再生过程中再生晶状体Pax6蛋白表达平均光密度与累积光密度测量结果  41-42
讨论  42-48
  4.1 两栖类晶状体发育、晶状体再生及其来源  42-43
  4.2 非洲爪蟾晶状体再生过程中Pax6蛋白表达免疫组织化学结果分析  43
  4.3 荧光定量结果分析  43-45
    4.3.1 眼睛发育过程中Pax6基因mRNA相对定量结果分析  43-44
    4.3.2 晶状体再生过程中Pax6基因mRNA相对定量结果分析  44-45
  4.4 Pax6表达检测结果比较  45
  4.5 非洲爪蟾与花背蟾蜍晶状体发育与再生过程中Pax6基因mRNA表达定量结果比较  45-46
  4.6 Pax6与β-crystallin、γ-crystallin的关系  46
  4.7 晶状体再生过程中，Real-Time PCR法与免疫组织化学法测定Pax6表达量的优缺点  46-48
结论  48-49
参考文献  49-54
在学期间的研究成果  54-55
致谢  55-56
缩略词表  56

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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