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绵羊CTLA-4胞外区对细粒棘球蚴EG95抗原的免疫佐剂作用

作　者: 张雯
导　师: 孙怀昌
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 细粒棘球蚴 EG95抗原 CTLA-4胞外区 免疫佐剂作用
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 24次
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内容摘要


细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)属于免疫球蛋白超家族成员,由IgV胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成。在免疫应答中,CTLA-4通过与CD28竞争结合抗原提呈细胞上的B7分子,为T细胞活化提供负调节信号。虽然游离的IgV胞外区仍能与B7分子结合,但不产生负调节信号,因此将其与目的抗原融合,能够发挥靶向抗原提呈和分子佐剂作用。本研究首先从绵羊外周血分离淋巴细胞,经ConA刺激活化后提取总RNA,然后用RT-PCR扩增出约400bp的IgV胞外区编码序列,将其克隆入T载体后进行测序,所得序列与GenBank中的绵羊CTLA-4胞外区序列进行比对分析,结果显示核苷酸序列同源性为99.7%,推导的氨基酸序列同源性为99.2%,仅31位的谷氨酸替换为甘氨酸,B7分子结合基序(MYPPPY)无变化。然后将IgV胞外区编码序列克隆入原核表达载体pET-30a,获得IgV胞外区融合表达载体pET-IgV,并在重组大肠杆菌中成功表达。用DNAStar软件包中的Protean程序对羊源六钩蚴EG95蛋白进行二级结构分析,根据其亲水性和抗原指数分析结果,选择抗原指数较高的17~132位氨基酸区域进行表达试验。利用Primer Premier5.0软件设计一对引物,以含3拷贝串联的EG95(3EG95)基因片段的重组质粒为模板,扩增出预期大小的3EG95基因片段,分别将其定向克隆入表达载体pET-IgV和pGEX-6p-1中,构建成重组表达质粒pET-IgV-3EG95和pGEX-3EG95。用IPTG对两个重组质粒转化的大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE分析显示表达的IgV-3EG95和GST-3EG95融合蛋白的分子量分别为60KDa和63KDa,均以包涵体形式存在。Western-blotting结果显示,两种融合蛋白均能被EG95抗血清识别。用包涵体纯化法获得纯化的IgV-3EG95和GST-3EG95融合蛋白,并用包涵体变性/复性获得可溶性蛋白。分别用纯化的包涵体和可溶性蛋白免疫小鼠,用间接ELISA测定免疫小鼠血清中的抗体水平,结果显示IgV-3EG95免疫组的EG95抗体产生时间为初免后第2周,抗体应答高峰期为初免后第5和6周,可溶性蛋白免疫组的ELISA效价高达1:10000,包涵体免疫组的ELISA效价为1:6400;GST-3EG95免疫组的EG95抗体产生时间为初免后第3周,抗体应答高峰期的ELISA效价为1:3200,可溶性蛋白与包涵体免疫组的抗体水平无差异。这些研究结果表明,绵羊CTLA-4胞外区能作为抗原提呈细胞靶向分子促进抗体应答,为细粒棘球蚴病重组亚单位疫苗的研制奠定了基础。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-9
符号说明  9-10
综述一 棘球蚴病疫苗研究进展  10-17
  1. 病原学与流行病学  10-11
  2. 预防的必要性  11
  3. 疫苗研究进展  11-14
  4. 展望  14
  5. 参考文献  14-17
综述二 细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4 的研究进展  17-28
  1. CTLA-4 的发现  17-18
  2. CTLA-4的分子结构  18-19
  3. CTLA-4基因结构及多态性  19
  4. CTLA-4的表达及调节  19-20
  5. CTLA-4的生物学功能  20-21
  6. CTLA-4与疾病治疗的关系  21-22
  7. CTLA-4分子的胞外区  22-23
  8. 参考文献  23-28
研究内容一 羊CTLA-4 IgV 区编码序列的克隆与表达  28-41
  1. 材料与方法  29-34
  2. 结果  34-38
  3. 讨论  38-39
  4. 参考文献  39-41
研究内容二 EG95 主要抗原表位区与绵羊 CTLA-419V 区的融合表达  41-53
  1. 材料与方法  42-46
  2. 结果  46-50
  3. 讨论  50-51
  4. 参考文献  51-53
研究内容三 羊CTLA-419V 区免疫佐剂作用的初步研究  53-60
  1. 材料与方法  53-56
  2. 结果  56-57
  3. 讨论  57-58
  4. 参考文献  58-60
结论  60-61
致谢  61

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学
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