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RNAi抑制Mx1基因表达对肿瘤VSV溶瘤敏感性的促进作用

作　者: 郭秉楠
导　师: 刘海燕
学　校: 苏州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 鼠黏病毒蛋白1(Mx1) 水泡性口膜炎病毒(VSV) 溶瘤 RNAi技术 人黏病毒蛋白A(MxA) 流式细胞术 儿童白血病 病毒感染
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


一、RNAi抑制Mx1基因表达对肿瘤VSV溶瘤敏感性的促进作用目的:实验研究5种肿瘤细胞系对于水泡性口膜炎病毒(VSV)溶瘤效应的敏感性;实验阐明I类干扰素下游的抗病毒蛋白-鼠黏病毒蛋白1(Mx1)基因的表达水平与肿瘤细胞对VSV病毒敏感性的相关性;应用RNAi干扰技术抑制Mx1基因的表达水平来提高水泡性口膜炎病毒溶瘤的敏感性。方法:首先将本实验室保种的VSV病毒在BHK细胞系上进行扩增并通过空斑实验进行病毒定量,将定量后的病毒保种并用来攻击5种不同种类的肿瘤细胞系:RAW264.7(小鼠巨噬细胞白血病),B16(黑色素瘤),Hepa1-6(小鼠肝癌),MHCC97-H(人肝癌高转移株),SMMC7721(人肝癌),48h后通过TCID50法和MTT法检测5种肿瘤细胞系对VSV病毒的敏感性;挑选其中三种鼠源的肿瘤细胞系进行RT-PCR检测I类干扰素下游的Mx1基因的基础表达水平,外源加入I类干扰素后Mx1基因的诱导表达水平以及VSV攻击三种肿瘤细胞株24h后Mx1基因的诱导表达水平从而证实肿瘤细胞系的溶瘤敏感性与Mx1基因表达的相关性;应用RNAi干扰技术抑制Mx1基因的表达水平,镜下观察联合MTT法检测RAW264.7细胞系(最不敏感细胞系)与B16细胞系(最敏感细胞系)溶瘤效果的改变。结果:VSV病毒的定量为9.5×106 pfu/ml。用VSV病毒攻击5种肿瘤细胞系呈现出的敏感性依次为B16﹥HEPA1-6﹥MHCC97-H﹥SMMC7721﹥RAW264.7。通过RT-PCR检测I类干扰素下游Mx1基因的基础表达水平,外源I类干扰素诱导Mx1基因的表达水平以及VSV病毒攻击三种鼠源肿瘤细胞系24小时后Mx1基因的诱导表达水平显示出Mx1基因的表达水平越高,肿瘤细胞对VSV病毒的敏感性越低,进而证实在肿瘤细胞中I类干扰素通路的活性与VSV病毒的溶瘤效果密切相关。同时应用RNAi技术抑制RAW264.7细胞系(最不敏感细胞系)Mx1基因的表达,该细胞系对VSV病毒溶瘤的敏感性提高了35%。最后,为了证实这种基因治疗的方法具有广泛的适用性并且为了安全性尽量少的应用病毒,我们应用RNAi技术抑制B16细胞系(最敏感细胞系) Mx1基因的表达,再用低剂量VSV病毒攻击该细胞系,该细胞系对VSV病毒溶瘤的敏感性提高了30%。证明通过RNAi基因治疗技术,可以有效地抑制肿瘤细胞系I类干扰素下游的抗病毒蛋白Mx1的表达水平,从而增强肿瘤对溶瘤病毒的敏感性,促进病毒的溶瘤作用,为病毒的溶瘤治疗提供了一条新的途径。结论:不同的肿瘤细胞对VSV病毒溶瘤的敏感性不同;肿瘤细胞对VSV病毒溶瘤的敏感性与肿瘤细胞I类干扰素通路下游的主要抗病毒蛋白Mx1的表达水平相关;应用RNAi技术抑制Mx1基因的表达水平可以显著地促进肿瘤细胞对VSV溶瘤的敏感性。二、利用荧光标记抗MxA单克隆抗体早期特异性检测儿童白血病伴发病毒感染目的:利用荧光标记抗人黏病毒蛋白A(MxA)单克隆抗体和流式细胞术早期特异性检测儿童白血病伴发的病毒感染。方法:荧光标记抗MxA单克隆抗体,检测其特异性;采集临床发热和不发热的白血病儿童外周血标本,分离外周血单个核细胞进行胞内染色,并用流式细胞术检测结果。结果:荧光染料直接标记MxA单克隆抗体具有较高的特异性;白血病儿童外周血单核细胞MxA表达水平与其临床病毒感染直接相关,并且检出MxA高表达较临床确诊病毒感染早7d;没有发热和临床确诊为细菌感染的病例均无检测到MxA的表达。结论:荧光标记抗MxA单克隆抗体应用于流式细胞术可以早期特异性地检测儿童白血病患者伴发的病毒感染,并且此方法简便易操作,具有应用于临床的前景。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-10
引言  10-12
第一章 不同肿瘤细胞株对VSV溶瘤敏感性的差异以及与Mx1基因表达水平的相关性  12-31
  一、材料与方法  15-20
  二、结果  20-28
  三、讨论  28-29
  参考文献  29-31
第二章 应用RNAi 技术抑制Mx1 基因的表达促进肿瘤VSV 溶瘤的敏感性  31-47
  一、材料与方法  34-39
  二、结果  39-44
  三、讨论  44-46
  参考文献  46-47
第三章 利用荧光标记抗MxA 单克隆抗体早期特异性检测儿童白血病伴发病毒感染  47-56
  一、材料与方法  48-50
  二、结果  50-54
  三、讨论  54-55
  参考文献  55-56
综述  56-67
附录  67-70
攻读学位期间本人出版或公开发表的论文、论著  70-71
致谢  71-72

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因工程的应用
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