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CpG-ODN对HepG2细胞及其相关因子的作用研究

作　者: 方丽娟
导　师: 孟民杰
学　校: 广东药学院
专　业: 病原生物学
关键词: CpG-ODN TLR9 肿瘤 凋亡 聚合酶链式反应 流式细胞术
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的研究未甲基化CpG寡核苷酸(CpG-ODN)对肝癌细胞HepG2的作用:一方面包括CpG-ODN通过具有TLR9阳性表达(TLR9~+)的人外周血单核细胞(PBMC)对HepG2的间接作用,另一方面包括CpG-ODN对TLR9~+ HepG2细胞的直接作用,以此对CpG-ODN在肿瘤免疫治疗中的安全性作出初步评价。方法主要包括三方面:1)提取含有CpG-ODN的质粒,用质粒CpG-ODN、多肽单独或联合刺激PBMC,之后与HepG2共孵育,分别提取两种细胞的总RNA,并进行反转录得到cDNA,设计合成MyD88、Caspase-8的PCR引物,以得到的cDNA为模版,β-actin为内参进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测MyD88、Caspase-8的表达情况;2)使用磷硫酰CpG-ODN刺激TLR9~+细胞,即PBMC和HepG2,提取总RNA进行反转录得到cDNA,设计合成抗凋亡因子Bcl-xL、Bcl-2,凋亡因子Bid以及TLR9的PCR引物,以β-actin为内参进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测Bcl-xL、Bid、Bcl-2、TLR9的表达情况;3)使用磷硫酰CpG-ODN刺激HepG2,流式细胞仪检测细胞周期。结果1、质粒CpG-ODN能诱导与HepG2共孵育后的PBMC高表达MyD88,间接影响HepG2中MyD88、Caspase-8的表达;2、CpG-ODN对PBMC中Bcl-xL、Bid表达有一定影响,对HepG2中Bcl-xL、Bcl-2、Bid表达的影响较明显,即当CpG-ODN的浓度在0~3μM范围内升高时,HepG2中抗凋亡基因Bcl-xL、Bcl-2的mRNA水平有降低趋势,凋亡因子Bid有增高趋势,抗凋亡因子与凋亡因子的比率减小;3、正常状态HepG2在0.5~2.5μM CpG-ODN作用下,细胞周期无明显变化;在2.5~25μM CpG-ODN作用下,HepG2细胞周期中的G1期增大,S+G2/M期减小;在25~50μM CpG-ODN作用下,G1期减小,S+G2/M期增大;4、生长状态不良的HepG2在CpG-ODN作用下,凋亡率APO明显增大,且呈剂量-效应依赖性。结论TLR信号通路中的关键接头分子——MyD88,该信号通路的激活可能是质粒CpG-ODN刺激PBMC杀伤肿瘤细胞的作用机制之一,此外PBMC杀伤HepG2的分子机制中可能涉及HepG2中Caspase-8的表达;CpG-ODN可能是通过调控Bcl-2家族成员表达而有诱导HepG2凋亡的趋势,这包括Bcl-xL、Bcl-2、Bid;在HepG2状态正常条件下,低浓度CpG-ODN(0.5~2.5μM)对HepG2细胞周期的作用不明显,中浓度CpG-ODN(2.5~25μM)对HepG2的增殖有一定的抑制作用,高浓度CpG-ODN(25~50μM)有促进HepG2增殖的趋势;在HepG2状态不良条件下,CpG-ODN可以促进HepG2细胞凋亡。

全文目录


中文摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-14
  一、研究背景  10-13
  二、本研究的目的和意义  13-14
第一部分 CpG-ODN 对PBMC 与HepG2 共孵育过程的作用  14-30
  引言  14
  1. 材料  14-17
    1.1 质粒、菌株和细胞等  14
    1.2 主要试剂  14-15
    1.3 主要试剂的配制  15-16
    1.4 主要仪器设备  16-17
  2. 方法  17-24
    2.1 CpG-ODN 质粒的大量制备，鉴定与浓度测定  17-19
    2.2 肿瘤细胞复苏与培养  19
    2.3 人外周血单个核细胞（PBMC）的分离，培养与活化  19-20
    2.4 肿瘤细胞的接种及培养  20-21
    2.5 活化的人外周血单个核细胞与肿瘤细胞的共孵育  21
    2.6 目的基因的检测  21-24
  3. 结果  24-28
    3.1 质粒的酶切电泳鉴定  24
    3.2 质粒的OD 值测定  24-25
    3.3 HepG2 细胞培养  25
    3.4 总RNA 电泳图  25
    3.5 MyD88、Caspase-8 的PCR 检测  25-28
    3.6 MyD88 基因的测序和序列比对  28
  4. 讨论  28-30
第二部分 CpG-ODN 对TLR9 阳性表达细胞的作用  30-38
  引言  30
  1. 材料  30-31
  2. 方法  31-32
    2.1 引物的设计与合成  31
    2.2 CpG-ODN 对PBMC 的作用  31-32
    2.3 CpG-ODN 对HepG2 的作用  32
  3. 结果  32-36
    3.1 PBMC 中Bcl-xL、Bid 的PCR 检测  32-33
    3.2 HepG2 中Bcl-xL、Bid、TLR9、Bcl-2 的PCR 检测  33-35
    3.3 不同寡脱氧核苷酸对HepG2 中Bid 表达的影响  35
    3.4 Bcl-xL 和Bid 基因的测序和序列比对  35-36
  4. 讨论  36-38
第三部分 CpG-ODN 的安全性评价研究  38-46
  引言  38
  1. 材料  38-39
    1.1 主要试剂  38
    1.2 主要试剂的配制  38
    1.3 主要仪器设备  38-39
  2. 方法  39-40
    2.1 HepG2 的孔板接种及培养  39
    2.2 CpG-ODN 直接刺激HepG2 及流式检测  39-40
    2.3 数据处理  40
  3. 结果  40-44
    3.1 不同浓度 CpG-ODN 对正常状态 HepG2 细胞周期的影响  40-42
    3.2 不同浓度 CpG-ODN 对不良状态 HepG2 细胞周期的影响  42-44
  4. 讨论  44-46
参考文献  46-53
全文总结  53-54
附录一 测序图谱  54-59
附录二 英文缩略词表  59-60
附录三 文献综述  60-67
附录四 攻读学位期间发表的论文  67-68
致谢  68

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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