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减蛋综合症基因工程疫苗的研制

作　者: 李莹
导　师: 李荣贵
学　校: 青岛大学
专　业: 微生物学
关键词: 减蛋综合症病毒基因工程疫苗分泌表达枯草芽孢杆菌
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

采用PCR技术扩增了减蛋综合症病毒纤维蛋白C-末端的编码基因,并将其克隆到表达载体pET-15b上构建了表达载体pET-15b-EDSC。将该重组质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株构建工程菌,SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导了纤维蛋白C-末端在工程菌中表达,并且目的蛋白主要以包涵体的形式存在。离心获得包涵体,洗涤后,用8mol/L尿素对其进行溶解。采用Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,将目的蛋白液透析过夜,冷冻干燥。为提高可溶性重组蛋白的量,将减蛋综合症病毒纤维蛋白C-末端的编码基因克隆到组成型分泌表达载体pUC18ompAcat上构建pUC18ompA-EDSC。将该重组质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株构建工程菌,培养工程菌以表达目的蛋白,SDS-PAGE分析表明,纤维蛋白C-末端在大肠杆菌中成功实现了表达,且部分重组蛋白分泌到了周质空间和胞外的培养基中,Ni2+-NTA树脂分离纯化后,Western blot对其免疫原性的分析表明,重组蛋白可与鸡抗EDSV血清发生特异反应,说明获得的纤维蛋白的C-末端具有明显的抗原性,该研究对于开发预防EDSV的基因工程疫苗的研究具有一定参考作用。为研究可溶性蛋白产量的提高,本文还对外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达做了初步的探讨,将重组质粒pUC18ompA-EDSC转化枯草芽孢杆菌构建工程菌,培养工程菌以表达目的蛋白,SDS-PAGE分析表明,纤维蛋白C-末端在枯草芽孢杆菌中成功的实现了表达,进一步证明了减蛋综合症病毒在其他工程菌中表达。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-7
引言  7-9
第1章减蛋综合症病毒纤维蛋白C-末端基因的克隆表达  9-15
  1.1 材料与方法  9-11
    1.1.1 实验材料及主要仪器  9
    1.1.2 实验方法  9-11
      1.1.2.1 表达载体和工程菌的构建  9-10
      1.1.2.2 纤维蛋白在工程菌中表达  10
      1.1.2.3 包涵体的洗涤与溶解  10
      1.1.2.4 重组蛋白的纯化  10
      1.1.2.5 目的蛋白的透析、干燥与溶解  10
      1.1.2.6 重组蛋白的抗原性鉴定  10-11
  1.2 结果  11-14
    1.2.1 纤维蛋白C-末端编码序列基因的PCR扩增  11-12
    1.2.2 含纤维蛋白C-末端编码序列基因原核表达载体的构建  12
    1.2.3 纤维蛋白工程菌的构建及表达  12
    1.2.4 重组基因工程菌表达情况鉴定  12-13
    1.2.5 包涵体洗涤与尿素溶解  13
    1.2.6 重组蛋白的纯化和抗原性分析  13-14
  1.3 讨论  14-15
第2章减蛋综合症病毒纤维蛋白C-末端基因在大肠杆菌中的分泌表达  15-20
  2.1 材料与方法  15-16
    2.1.1 实验菌株、质粒及主要仪器  15
    2.1.2 实验方法  15-16
      2.1.2.1 重组质粒pUC18ompAcat-EDSC的构建  15
      2.1.2.2 重组质粒工程菌的构建及蛋白表达  15-16
      2.1.2.3 重组蛋白在周质空间腔中表达的检测  16
      2.1.2.4 重组蛋白在培养物上清中的检测  16
      2.1.2.5 重组蛋白的纯化  16
      2.1.2.6 重组蛋白的抗原性鉴定  16
  2.2 结果  16-19
    2.2.1 重组表达质粒pUC18ompA-EDSC的构建  16-17
    2.2.2 pA-EDSC 工程菌的全蛋白表达及检测  17
    2.2.3 重组蛋白的纯化及分泌情况分析  17-18
    2.2.4 重组蛋白的抗原性分析  18-19
  2.3 讨论  19-20
第3章纤维蛋白的C-末端基因在枯草芽孢杆菌中表达  20-25
  3.1 材料与方法  20-21
    3.1.1 菌株、质粒及主要仪器  20
      3.1.1.1 枯草转化相关试剂的配制  20
    3.1.2 实验方法  20-21
      3.1.2.1 EDSC表达质粒的构建  20
      3.1.2.2 ESDC表达质粒转化枯草芽孢杆菌  20-21
      3.1.2.3 阳性克隆筛选及鉴定  21
      3.1.2.4 EDSC在枯草芽孢杆菌中的表达及纯化  21
      3.1.2.5 减蛋综合症纤维蛋白的SDS-PAGE和Western-blotting分析  21
  3.2 结果  21-23
    3.2.1 pA-EDSC质粒转化枯草芽孢杆菌的鉴定  21-22
    3.2.2 pA-EDSC的胞内表达及纯化  22-23
    3.2.3 减蛋综合症纤维蛋白表达的Western-blotting分析结果  23
  3.3 讨论  23-25
参考文献  25-28
综述  28-40
  参考文献  36-40
攻读学位期间的研究成果  40
附录  40-43
致谢  43-44

减蛋综合症基因工程疫苗的研制

内容摘要

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