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羽毛降解菌枯草芽孢杆菌B-3的分离鉴定及角蛋白酶基因的克隆表达

作　者: 赖欣
导　师: 陈惠
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 角蛋白酶 枯草芽孢杆菌B-3 筛选 基因克隆 原核表达
分类号: S816
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 373次
引　用: 1次
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内容摘要


角蛋白酶(keratinase)是一种能特异降解角蛋白的蛋白酶。近年来随着角蛋白酶在去垢剂的制造、皮革加工、食品工业和饲料生产中广泛的应用而日益受到人们的青睐。本文以四川农业大学养鸡场堆砌废弃羽毛处采集的土壤为样品,筛选出一株可以利用羽毛并能高效降解羽毛粉的枯草芽孢杆菌,并克隆了其kerC基因和实现了该基因在大肠杆菌中融合表达。1.从四川农业大学养鸡场长期堆砌废弃羽毛处采集的土壤中筛选出了具有降解角蛋白能力的7株细菌。对其中产角蛋白酶酶活的最高的B-3菌株进行了形态观察、生理生化特性以及系统发育树分析,鉴定B-3为枯草芽孢杆菌,该菌发酵产角蛋白酶酶活力可达2.261U/mL。2.利用PCR技术克隆了编码枯草芽孢杆菌B-3的角蛋白酶基因。该基因序列全长1146bp,编码381个氨基酸,含信号肽序列。与GenBank数据库比对分析发现该基因与数据库中来自枯草芽孢杆菌YYW-1的kerC基因(GenBank No.:EU362730)相似性达到100%。蛋白结构域分析显示,kerC含两个丝氨酸蛋白酶家族的保守结构域,属于丝氨酸蛋白酶家族成员。3.以克隆的枯草芽孢杆菌B-3角蛋白酶基因为基础,利用大肠杆菌表达载体pET-32a(+)构建kerC原核表达载体pET-kerC,并转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达。结果表明,该酶在大肠杆菌中获得了高效表达,在重组菌细胞裂解上清液中检测到角蛋白酶活性,酶活力可达14.814U/mL,比活力可达0.0852 IU/mg。SDS-PAGE分析表明,重组角蛋白酶分子量为60kDa左右(融合了硫氧还蛋白,Trx)。对重组角蛋白酶酶学性质分析表明,该酶的最适反应温度为65℃,最适pH值为7.0,热稳定性较差,耐碱(pH5.5-10.0处理后残余酶活力可保持最高酶活的80%以上)。

全文目录


中文摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章 文献综述  10-17
  1.1 角蛋白  10-11
  1.2 产角蛋白酶的微生物  11
  1.3 角蛋白酶活力测定方法  11-12
  1.4 角蛋白酶的分类及理化性质  12-13
  1.5 角蛋白酶的分子生物学研究  13-14
  1.6 角蛋白酶作用的机理  14-15
  1.7 角蛋白酶的应用  15
  1.8 角蛋白酶的研究现状及其应用存在的问题  15-16
  1.9 本研究的目的及意义  16-17
第二章 角蛋白降解菌Bacillus subtilis B-3的分离与鉴定  17-30
  1 材料  17-19
    1.1 样品来源  17
    1.2 培养基  17
    1.3 分子生物学试剂  17-18
    1.4 主要药品  18
    1.5 主要仪器  18
    1.6 溶液配制  18-19
      1.6.1 DNA提取溶液  18
      1.6.2 琼脂糖电泳缓冲液  18-19
      1.6.3 角蛋白酶酶活测定溶液  19
  2 方法  19-24
    2.1 菌种的筛选  19-20
      2.1.1 富集培养  19
      2.1.2 菌种的分离  19
      2.1.3 角蛋白酶产生菌的初筛  19-20
      2.1.4 角蛋白酶发酵  20
    2.2 菌种的鉴定  20-23
      2.2.1 生理生化鉴定  20
      2.2.2 基因组总DNA提取  20
      2.2.3 16s rDNA扩增  20-21
      2.2.4 PCR产物的纯化  21
      2.2.5 扩增片段的T载体克隆  21-22
      2.2.6 阳性克隆菌株的筛选及鉴定  22-23
      2.2.7 系统进化树分析  23
    2.3 酶活的测定  23-24
      2.3.1 角蛋白酶活测定方法  23-24
      2.3.2 角蛋白酶活力的计算  24
  3 结果  24-29
    3.1 角蛋白酶产生菌的分离与筛选  24
    3.2 羽毛降解实验  24-26
    3.3 细菌鉴定  26-29
      3.3.1 形态学观察  26
      3.3.2 生理生化培养特性  26-27
      3.3.3 16S rDNA的扩增与序列分析  27-29
  4 讨论  29-30
第三章 枯草芽孢杆菌kerC基因的克隆及其在E.coli(DE3)中的融合表达  30-53
  1 材料  30-34
    1.1 菌株及载体  30-31
    1.2 分子生物学试剂  31-32
    1.3 培养基  32
    1.4 常用缓冲液  32-33
    1.5 角蛋白酶酶活测定溶液  33-34
    1.6 主要仪器  34
  2 方法  34-42
    2.1 kerC基因克隆  34-37
      2.1.1 基因组总DNA提取  34
      2.1.2 引物设计  34-35
      2.1.3 kerC基因PCR扩增  35
      2.1.4 PCR产物的纯化  35
      2.1.5 目的片段与T载体连接  35-36
      2.1.6 转化  36
      2.1.7 重组克隆质粒检测  36
      2.1.8 序列测定与分析  36-37
    2.2 kerC基因在E.coli BL21中原核表达  37-40
      2.2.1 kerC基因高保真扩增  37
      2.2.2 PCR产物的纯化  37
      2.2.3 表达载体质粒及目的片段酶切消化  37-38
      2.2.4 酶切产物纯化  38
      2.2.5 连接  38
      2.2.6 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备  38
      2.2.7 转化  38-39
      2.2.8 阳性菌株的筛选及鉴定  39-40
    2.3 重组菌株pET-kerC在大肠杆菌中的诱导表达  40-41
      2.3.1 重组菌株的诱导表达及酶活测定  40
      2.3.2 重组蛋白His-Tag纯化  40
      2.3.3 重组菌株的SDS-PAGE分析  40-41
    2.4 角蛋白酶酶学性质研究  41-42
      2.4.1 重组角蛋白酶最适反应温度的测定  41
      2.4.2 重组角蛋白酶热稳定性的测定  41-42
      2.4.3 重组角蛋白酶最适反应pH的测定  42
      2.4.4 重组角蛋白酶pH稳定性的测定  42
  3 结果与分析  42-50
    3.1 角蛋白酶基因kerC克隆  42-46
      3.1.1 角蛋白酶基因表达片段的扩增  42-43
      3.1.2 DNA测序和生物信息学分析  43-46
    3.2 重组表达载体的构建  46-47
    3.3 kerC诱导表达  47-48
    3.4 酶活测定  48
    3.5 重组角蛋白酶酶学性质研究  48-50
      3.5.1 的最适反应温度  48
      3.5.2 角蛋白酶热稳定性  48-49
      3.5.3 角蛋白酶的最适反应pH  49-50
      3.5.4 角蛋白酶的pH稳定性  50
  4 讨论  50-53
    4.1 kerC基因克隆  50-51
    4.2 kerC基因原核表达  51-53
结论  53-54
参考文献  54-58
致谢  58-59
攻读硕士期间发表论文  59

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 普通畜牧学 > 饲料
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