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长循环靶向性载药胶束的构建及其细胞水平评价

作　者: 陈汉
导　师: 张其清
学　校: 北京协和医学院
专　业: 生物医学工程
关键词: 聚合物胶束叶酸受体靶向香豆素6 受体上调摄取
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

聚合物胶束是当前药物传输领域研究的热点,在用作药物载体时具有多个优点,如对疏水性或难溶性药物的增溶作用,聚合物亲水链由一定长度的聚乙二醇等组成时可具备长循环性,而在聚合物胶束的表面修饰以靶识别分子可使其具备主动靶向性。本文制备了载香豆素6和米托蒽琨的聚合物胶束,并研究了地塞米松处理对Hela细胞摄取叶酸偶联载香豆素6胶束的影响。首先,以双氨基PEG (PEG-bis-amine)、叶酸(folate)、磷脂酰乙醇胺(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine, DSPE)为原料合成了叶酸-PEG-磷脂酰乙醇胺(folate-PEG-DSPE),并利用傅立叶红外波谱仪和核磁共振谱仪对终产物进行了结构表征,结果证实所得到的终产物为目标化合物；还利用高效液相色谱法对得到的终产物进行了含量分析；然后,以甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)和合成的叶酸-PEG-磷脂酰乙醇胺(folate-PEG-DSPE)为材料,通过膜水化法制备出载香豆素6(coumarin6)的普通胶束(plain micelles)和叶酸偶联胶束(folate-conjugated micelles)。分别采用透射电镜和激光粒度分析仪对胶束的形态和粒径分布进行了检测,发现透射电镜下的干燥胶束粒径约50-60nm,而溶液状态下的胶束平均粒径约100nm;还利用高效液相色谱法分别检测了胶束溶液的香豆素6浓度,并计算出了聚合物胶束的载药量和包封率分别约为0.8%和15.4%；此外,还利用高效液相色谱法检测了叶酸偶联胶束中的folate-PEG-DSPE,实验结果表明,膜水化法是制备载药聚合物胶束的适宜方法,所制备的叶酸偶联胶束含有folate-PEG-DSPE.实验结果还表明,聚合物胶束对于疏水性小分子药物具有显著的增溶作用；其次,以甲氧基聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺为材料,利用膜水化法制备包载水溶性较好的蒽环类抗肿瘤药米托蒽醌盐酸盐(mitoxantrone hydrochloride)的聚合物胶束,考察了磷脂酰乙醇胺对米托蒽琨包封率和载药量的影响。动态光散射法考察了胶束的粒径分布,其平均粒径约10nm；发现磷脂酰乙醇胺的添加可以使聚合物胶束对米托蒽醌的包封率和载药量增加达23%左右；然后,考察了叶酸受体α阳性的Hela细胞对载香豆素6的普通胶束和叶酸偶联胶束的体外摄取实验,利用荧光显微镜和流式细胞仪考察Hela细胞对于叶酸偶联胶束的摄取作用,发现Hela细胞对于叶酸偶联胶束的摄取明显高于普通胶束,证明通过叶酸小分子与细胞表面的叶酸受体a的特异性识别和结合作用,可以促进细胞对于叶酸偶联载药胶束的摄取；最后,研究了地塞米松处理对于Hela细胞摄取载香豆素6的叶酸偶联胶束的影响。利用多个剂量(5nM,50nM,100nM)的地塞米松处理Hela细胞96h,并用实时定量PCR技术和流式细胞技术分别检测了处理后Hela细胞的mRNA水平和细胞表面FRa水平,发现地塞米松处理后的Hela细胞的mRNA水平增加了近3倍,而Hela细胞表面FRa水平增加了1倍多；在5nM地塞米松处理96h的Hela细胞中加入叶酸偶联胶束,以未经处理的Hela细胞为对照,采用荧光显微镜和流式细胞仪考察细胞摄取量,发现地塞米松处理的Hela细胞对叶酸偶联胶束的摄取增加了近1倍,也即说明通过上调细胞表面FRa水平可以增强叶酸偶联胶束在肿瘤细胞的内吞。本研究成功制备了载香豆素6的普通胶束和叶酸偶联胶束,动态光散射法检测的平均粒径约100nm；此外,还制备了载米托蒽醌的聚合物胶束,平均粒径约10nm,磷脂酰乙醇胺可以增加聚合物胶束对于米托蒽醌的载药量和包封率;在细胞水平证实了通过地塞米松可以上调Hela细胞的FRα表达水平,继而促进其对叶酸偶联载药胶束的摄取。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章文献综述  12-41
  1. 药物载体及其特性  12-16
    1.1 药物载体的基本特性---长循环性  12-14
    1.2 药物载体的主动靶向性  14-16
  2. 用作药物载体的聚合物胶束  16-20
    2.1 聚合物胶束对难溶性药物的增溶作用  16-17
    2.2 聚合物胶束的组成  17-18
    2.3 脂质为内核的胶束  18-19
    2.4 聚合物胶束制剂临床试验的最新进展  19-20
  3. 叶酸受体介导的靶向药物传输  20-26
    3.1 叶酸受体概述  20-21
    3.2 叶酸受体靶向的实现策略  21-22
    3.3 叶酸直接偶联药物分子的靶向传输  22-23
    3.4 叶酸偶联药物载体的靶向传输  23-25
    3.5 叶酸偶联物制剂临床试验的最新进展  25
    3.6 肿瘤组织FRs表达量的局限性及其上调  25-26
  4. 研究目的和内容  26-28
  参考文献  28-41
第二章 Folate-PEG-DSPE的合成和表征  41-55
  1. 引言  41-42
  2. 仪器和材料  42
    2.1 仪器  42
    2.2 材料  42
  3. 实验方法  42-46
    3.1 合成路线  42-43
    3.2 实验步骤  43-46
      3.2.1 叶酸的活化和folate-PEG-amine的合成  43-45
      3.2.2 N-Suc-DSPE的合成  45-46
      3.2.3 Folate-PEG-DSPE的合成和纯化  46
  4. 结果与讨论  46-53
    4.1 离子交换柱层析监测谱图及纯化后样品的液相谱图  46-48
      4.1.1 柱层析  46-47
      4.1.2 离子交换柱层析纯化样品的HPLC分析  47-48
      4.1.3 Folate-PEG-amine的核磁氢谱  48
    4.2 N-Suc-DSPE合成反应的TLC监测及产物的结构表征  48-51
      4.2.1 反应终止时的TLC显色图  48
      4.2.2 N-Suc-DSPE的红外光谱  48
      4.2.3 N-Suc-DSPE的核磁氢谱  48-51
    4.3 folate-PEG-DSPE的核磁氢谱(~1H NMR)表征  51-53
      4.3.1 folate-PEG-DSPE的核磁氢谱  51-52
      4.3.2 HPLC法分析folate-PEG-DSPE  52-53
  5. 小结  53-54
  参考文献  54-55
第三章载香豆素6胶束的制备及表征  55-65
  1. 引言  55-56
  2. 仪器和材料  56
    2.1 仪器  56
    2.2 材料  56
  3. 实验部分  56-58
    3.1 载香豆素6胶束的制备方法  56-57
    3.2 透射电镜观察胶束的形态和粒径  57
    3.3 动态光散射法检测胶束粒径  57
    3.4 高效液相色谱法建立香豆素6含量测定的标准曲线  57
    3.5 胶束的载药量和包封率测定  57
    3.6 高效液相色谱法分析叶酸偶联胶束中的Folate-PEG-DSPE  57-58
    3.7 胶束稳定性的考察  58
  4. 结果与讨论  58-61
    4.1 载香豆素6普通胶束和叶酸偶联胶束的透射电镜形态  58
    4.2 动态光散射法检测胶束粒径  58-59
    4.3 高效液相色谱法分析胶束的载药量和包封率  59-61
    4.4 叶酸偶联胶束中Folate-PEG-DSPE的HPLC分析  61
    4.5 载香豆素6胶束的稳定性考察  61
  5. 小结  61-63
  参考文献  63-65
第四章载米托蒽醌聚合物胶束的制备及表征  65-73
  1. 引言  65-66
  2. 仪器和材料  66
    2.1 仪器  66
    2.2 材料  66
  3. 实验方法  66-68
    3.1 载米托蒽醌的胶束制备方法  66-67
    3.2 添加磷脂酰乙醇胺的载米托蒽醌胶束的制备  67
    3.3 动态光散射法检测载米托蒽醌胶束的粒径分布  67
    3.4 高效液相色谱法建立米托蒽醌含量测定的标准曲线  67
    3.5 胶束的载药量和包封率测定  67
    3.6 胶束稳定性的考察  67-68
  4. 结果与讨论  68-71
    4.1 载米托蒽醌的胶束的粒径分析  68-69
    4.2 高效液相色谱法分析胶束的载药量和包封率  69-70
    4.3 DSPE的添加对于载米托蒽醌胶束载药量和包封率的影响  70-71
    4.4 三乙胺在制备载米托蒽醌的聚合物胶束中的作用  71
    4.5 载米托蒽醌聚合物胶束的稳定性  71
  5. 小结  71-72
  参考文献  72-73
第五章叶酸偶联胶束的细胞水平评价  73-82
  1. 引言  73-74
  2. 仪器和材料  74-75
    2.1 仪器  74
    2.2 材料  74-75
  3. 实验方法  75-76
    3.1 Hela细胞的培养  75
    3.2 荧光显微镜观察Hela细胞对载药胶束的摄取  75
    3.3 流式细胞仪定量分析Hela细胞对载药胶束的摄取  75
    3.4 游离叶酸对FR介导的内吞作用的影响  75-76
  4. 结果与讨论  76-80
    4.1 荧光显微镜观察Hela细胞对普通胶束和叶酸偶联胶束的摄取  76-77
    4.2 流式细胞仪分析Hela细胞对普通胶束和叶酸偶联胶束的摄取  77
    4.3 游离叶酸对FR介导的内吞作用的抑制作用及无叶酸培养基的使用  77-80
  5. 小结  80-81
  参考文献  81-82
第六章叶酸受体α上调对于Hela细胞摄取叶酸偶联胶束的影响  82-98
  1. 引言  82-83
  2. 仪器和材料  83
    2.1 仪器  83
    2.2 材料  83
  3. 实验方法  83-89
    3.1 常用溶液的配制  83-84
    3.2 Hela细胞的常规培养  84
    3.3 Hela细胞用不同剂量地塞米松处理96小时  84
    3.4 实时荧光定量PCR法检测地塞米松对FRα mRNA水平的影响  84-87
    3.5 流式细胞仪检测地塞米松处理Hela细胞后FR-α表达水平  87-88
      3.5.1 用Alexa fluor 488试剂盒标记FRα单抗和同型对照抗体(Isotype IgG)  87
      3.5.2 地塞米松处理96h Hela细胞的收集  87-88
      3.5.3 Alexa fluor 488标记的FRα单抗与细胞的孵育  88
      3.5.4 单抗结合的Hela细胞的固定及上机检测  88
    3.6 荧光显微镜定性观察地塞米松处理的Hela细胞对叶酸偶联胶束的摄取  88
    3.7 流式细胞仪定量分析Hela细胞对普通胶束和叶酸偶联胶束的摄取  88-89
  4. 结果与讨论  89-95
    4.1 地塞米松对Hela细胞叶酸受体α表达水平的上调作用  89-93
      4.1.1 RT-PCR技术检测地塞米松处理后的Hela细胞FRαmRNA水平  89-91
      4.1.2 流式细胞术检测地塞米松处理后的Hela细胞表面FRα水平变化  91-92
      4.1.3 地塞米松处理对于Hela细胞形态及增殖活性的影响  92-93
    4.2 地塞米松处理对Hela细胞摄取叶酸偶联胶束的影响  93-95
      4.2.1 荧光显微镜观察地塞米松处理后的Hela细胞对叶酸偶联胶束的摄取  93-94
      4.2.2 流式细胞仪分析地塞米松处理后的Hela细胞对叶酸偶联胶束的摄取  94-95
  5. 小结  95-96
  参考文献  96-98
全文总结  98-100
主要创新点  100-101
论文发表情况  101-102
致谢  102

长循环靶向性载药胶束的构建及其细胞水平评价

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