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若干钙调控蛋白在小鼠ES细胞衍生神经元内质网钙储存及神经发生中的作用

作　者: 高益宁
导　师: 楼宜嘉
学　校: 浙江大学
专　业: 药理学
关键词: 小鼠胚胎干细胞神经分化内质网钙储存 SERCA活性囊泡摄取功能 MAPK Junctophilin-3，Junctophilin-4
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

钙离子在细胞膜和内质网(endoplasmic reticulum, ER)膜之间的流动对神经元的基础功能发挥着关键性的作用,而内质网作为胞内重要的钙储存细胞器,参与调节胞内钙平衡,调控各种信号通路,介导细胞蛋白合成、信号传导等过程。本实验以小鼠胚胎干(embryonic stem, ES)细胞体外定向分化神经元为模型,模拟胚胎神经发育过程,考察若干钙调控蛋白在小鼠ES细胞衍生神经元内质网钙储存及神经发生中的作用。内质网中的钙离子动态平衡过程由兰尼碱受体(ryanodine receptors, RyRs)、IP3受体(inositol 1,4,5-triphosphate receptors, IP3Rs)以及肌(内)质网Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)协调运作控制。其中,SERCA蛋白能量依赖性的钙回调作用对内质网钙平衡至关重要。本实验考察了ES细胞神经元分化过程中内质网钙储存及钙释放特征,并探索SERCA在神经元功能性发育中潜在作用及可能的分子机制。Junctophilins (JPs)是一类被证实存在于兴奋期细胞中的Ca2+平衡调控蛋白,神经细胞表达Junctophilin 3 (JP-3), Junctophilin 4 (JP-4)两种亚型。Jp-3,Jp-4基因敲除小鼠特征性表现出运动协调功能失常、平衡能力损伤并伴有记忆损伤。本研究利用ES细胞体外分化为神经元模型,探索Jp-3,Jp-4在胚胎神经发育过程中的作用。第一章SERCA在小鼠ES细胞衍生神经元内质网钙储存以及神经突起发育中的作用目的：探索小鼠胚胎干细胞神经分化过程中内质网钙储存及钙释放特征,并探索内质网钙泵蛋白SERCA在神经元功能性发育中潜在的作用。方法：采用经典的4-/4+法诱导小鼠ES细胞定向分化为神经元,10-7mol/L全反式维甲酸(Retinoic acid, RA)为阳性对照,0.1%二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照。在分化培养终点(贴壁铺展培养d 8+10),光镜和免疫荧光成像法鉴定神经元形成(轴突长度是胞体长度的3倍及以上),细胞微管蛋白(p-tubulinⅢ)阳性。分别收集ES细胞、拟胚体(embryoid bodies, EBs)、贴壁培养d 8+0、d 8+5和d 8+10细胞样本,以RT-PCR及Western-blot法,评价内质网相关钙调控蛋白RyRs. IP3受体及SERCA在各个神经分化时期表达特征。以神经前体细胞标志蛋白(nestin),成熟神经元标志蛋白(p-tubulinlll),神经轴突标志蛋白(neurofilaments, NEFM)和神经树突标志蛋白(microtubule-associated protein 2, MAP2)表达评价分化情况；FM1-43荧光染色观察分化成熟神经元囊泡摄取功能。选取分化早期d 8+3神经前体细胞及d 8+10分化成熟神经元,经由活细胞工作站检测其内质网钙释放功能。以10-6mol/L SERCA抑制剂(cyclopiazonic acid, CPA)论证SERCA对神经分化的特定作用。观察CPA是否影响RA促神经分化作用及神经元囊泡摄取功能。同时利用Western-blot法检测MAPK通路中ERK, JNK, p38磷酸化等相关分子事件的变化,以探索RA促神经分化过程SERCA的可能机制。结果：小鼠ES细胞定向分化神经元过程中,内质网钙相关蛋白SERCA、RyRs和IP3Rs表达均随分化时相依赖性上调。神经前体细胞即具有内质网钙释放功能,成熟神经元中此功能进一步增强。SERCA抑制剂CPA能显著减少RA促ES细胞分化为神经细胞,抑制神经元轴突和树突发育,并抑制神经元囊泡摄取功能。提示SERCA具有调控神经分化作用,特别体现在促轴突和树突发育以及囊泡摄取功能。CPA可下调MAPK通路中ERK, JNK和p38的磷酸化,提示内质网钙储存对神经分化调节作用尚伴随MAPK家族蛋白的激活。结论：RA促小鼠ES细胞定向分化神经过程,呈现内质网钙储存及释放功能,该功能存在于神经细胞分化早期,且随分化进程呈上调趋势。抑制SERCA钙离子泵功能,不仅降低内质网钙储存,尚呈现抑制神经分化作用,特别是影响轴突和树突发育,并抑制了神经囊泡摄取功能。神经分化过程中SERCA活性伴有MAPK家族蛋白磷酸化参与。第二章Jp-3,Jp-4基因对小鼠ES细胞衍生神经元胚层发育、线粒体表达及神经递质分泌的影响目的：探索ES细胞衍生神经元Ca2+平衡调控蛋白基因(Junctophilin 3, Junctophilin 4, Jp-3, Jp-4),在神经分化中的作用,及其与神经元线粒体功能和神经递质分泌功能的关系。方法：小鼠ES细胞神经分化早期,小干扰Jp-3,Jp-4(siRNA),收集铺展分化培养d 8+0、d 8+2、d 8+6、d 8+8各时期细胞样本,RT-PCR法考察分化相关基因OCT3/4(未分化ES细胞标志基因)、Fg35(外胚层发育标志基因)、Brachy(中胚层发育标志基因)、AFP(内胚层发育标志基因)、nestin(神经前体细胞标志基因)的表达。贴壁培养d 8+0、d 8+5、d 8+10(神经分化终点)各时期,评价线粒体融合蛋白基因Mfn1、Mfn2,过氧化物酶增殖激活受体辅酶激活因子PGC1-α及核呼吸因子NRF-1的表达特征。MitoTracker* Red标记活细胞线粒体,细胞免疫化学检测siJp-3, Jp-4神经元线粒体完整性。RT-PCR法检测神经细胞分化终点相关神经递质标志性蛋白泡状谷氨酸盐转运体(vesicular glutamate transporters, VGluTl),谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase 65, GAD65),乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)基因表达。结果：siJp-3, siJp-4可显著降低外胚层Fgf5转录,部分减少神经前体细胞nestin转录,对其他胚层相关基因表达则影响不明显。siJp-3, siJp-4尚可损伤线粒体完整性,表现为线粒体荧光强度降低,且在轴突和树突内分布减少。siJp-3, siJp-4抑制了线粒体结构与功能基因Mfn1、Mfn2、PGC1-a及NRF-1的转录。同时,siJp-3, Jp-4也可抑制分化终点成熟神经元神经递质标志性蛋白VGluTl、GAD65、AchE的基因表达,提示Jp-3,Jp-4缺失可导致相应的神经递质合成降低。结论：小鼠ES细胞神经分化过程中,Ca2+平衡调控蛋白基因Jp-3,Jp-4正常表达与神经分化、线粒体功能及神经递质的分泌呈密切相关性。

若干钙调控蛋白在小鼠ES细胞衍生神经元内质网钙储存及神经发生中的作用

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