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PPARγ激动剂体外筛选模型的建立及其应用

作　者: 刘治国
导　师: 肖晓秋
学　校: 重庆医科大学
专　业: 药理学
关键词: PPARγ 罗格列酮报告基因 2型糖尿病脂联素
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景2型糖尿病是由多种因素引起的机体组织对胰岛素敏感性降低而导致的胰岛素抵抗状态。随着生活水平的提高，在营养过剩、久坐少动时间增加及工作压力过大的交叉影响下，糖尿病的发生率在快速攀升。根据国际糖尿病联盟（IDF）公布的数据，目前全球有3.71亿糖尿病患者，而中国糖尿病患者人数已超过9200万，其中90%以上的糖尿病属于2型糖尿病。糖尿病已成为继肿瘤和心脑血管疾病之后威胁我国国民健康的第三大疾病。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activatedreceptor γ, PPARγ）是一种配体激活的核受体转录因子，在脂肪细胞分化过程中发挥关键作用。噻唑烷二酮类（Thiazolidinediones, TZDs）药物，如罗格列酮，是PPARγ的激动剂，能够改善胰岛素抵抗，主要用于治疗2型糖尿病。基于细胞水平转录实验，PPARγ激动剂可分为完全激动剂和部分激动剂。罗格列酮通常被看作是PPARγ完全激动剂。与PPARγ完全激动剂相比PPARγ部分激动剂具有相似的胰岛素增敏作用，并且副作用更少，具有更好的安全性。因此有必要去寻找新的安全有效的PPARγ部分激动剂。方法：用LipofectamineTM2000将含有PPAR γ基因质粒（pIRES-PPAR γ）、萤火虫荧光素酶报告基因质粒（pPPRE×3-TK-Luciferase）以及内参照质粒（pRL-TK）按不同比例共转染入HEK293细胞，并对三种质粒比例进行优化；用不同配体处理转染三种质粒的HEK293细胞，通过检测荧光素酶相对活性以确定加入配体对PPARγ的激动效应；采用经典的PPARγ激动剂和PPARγ特异性拮抗剂，其他核受体激动剂以及PPARα激动剂考察不同化合物对PPARγ的激动程度，确定模型的特异性；以Z’值考察模型重复性；并观察了PPARγ激动剂的作用时间特点。在筛选的候选化合物中，化合物CMHX008有较好的PPARγ激动活性；3T3-L1细胞按常规诱导分化，在分化第2天加入CMHX008和罗格列酮，在分化第7天分别进行油红O染色，形态学上观察细胞分化程度；在490nm波长下检测细胞内甘油三酯（TG）含量，考察细胞脂质合成能力；Q-PCR和ELISA方法进一步研究CMHX008对脂联素和aP2表达的影响。结果：PPARγ质粒、报告基因质粒以及内参照质粒比例为2：6：1时相对荧光素酶活性最高；PPARγ激动剂罗格列酮可显著增加相对荧光素酶的活性而GW9662可抑制这种作用，且相对荧光素酶的活性随着处理时间的增加而升高；地塞米松，全反式维甲酸，雌二醇和非诺贝特无上述活性；根据9次重复实验结果计算Z’值为0.70。CMHX008能够增加PPARγ的活性，但作用强度低于罗格列酮；油红O染色和TG含量结果表明CMHX008能够促进3T3-L1前脂肪细胞分化和脂质沉积，但程度均较罗格列酮弱； Q-PCR和ELISA结果显示CMHX008具有类似罗格列酮增加脂联素表达和分泌的能力，但对aP2表达的促进作用要显著低于罗格列酮。结论：本次实验成功构建了一种PPARγ激动剂筛选模型；该模型特异性和重复性较好；利用该筛选模型对新化合物进行测试结果表明，CMHX008是一种新的PPARγ部分激动剂，在保留类似罗格列酮胰岛素增敏作用同时，脂质沉积等不良反应更少。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-14
前言  14-18
  参考文献  16-18
材料和方法  18-25
结果  25-31
讨论  31-34
参考文献  34-37
全文总结  37-39
文献综述  39-47
  参考文献  43-47
致谢  47-48
攻读硕士学位期间的研究成果和发表论文  48-49

PPARγ激动剂体外筛选模型的建立及其应用

内容摘要

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