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麦迪霉素C-3位羟基-0-酰基化酶基因（mdmB）在生米卡链霉菌中的表达

作　者: 于春波
导　师: 韩威
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 生米卡链霉菌 麦迪霉素A1（MDMA1） C-3位羟基-O-酰基化酶基因(mdmB) 单交换同源重组 重组高产菌
分类号: R91
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


国产麦迪霉素（MDM）主组分A1含量低，并含有大量的柱晶白霉素A6（LMA6）等组分，（MDMA1与LMA6结构上的区别在于前者C-3位上为丙酰基，而后者为乙酰基），其原因：首先是C-3位羟基-O-酰基化酶合成的量可能不够或活性不高，不能将底物全部酰化。二是C-3位羟基-O-酰基化酶的选择性不高。为了增加MDMA1组分的产量，本论文从增加麦迪霉素C-3位羟基-O-酰基化酶基因（mdmB）剂量入手，首次分别把带有PermE*、PmerR启动子并同时带有to终止子的mdmB基因引入生米卡链霉菌S. mycarofaciens var. 464中，并筛选到重组高产菌。为实现增加mdmB基因剂量，以pKC1139为载体，分别构建了表达质粒pSPU271（带有PermE*启动子、mdmB基因、to终止子）和pSPU277（带有PmerR启动子、mdmB基因、to终止子），之后分别以原生质体转化和接合转移两种方式转化生米卡链霉菌S. mycarofaciens var. 464，未获得转化子。用本室构建的重组质粒pSPU240（以pSET152为载体）建立了高效转化生米卡链霉菌S. mycarofaciens var. 464的接合转移系统，接着以pSET152为载体，分别构建了表达质粒pSPU281（带有PermE*启动子、mdmB基因、to终止子）和pSPU287（带有PmerR启动子、mdmB基因、to终止子）。以接合转移的方法将质粒pSPU287和pSPU281导入生米卡链霉菌S. mycarofaciens var. 464，获得的接合子经PCR扩增出了含有外源启动子的mdmB基因的条带。筛选了200株pSPU287和pSPU281的接合子，获得了重组高产菌287-53，分析重组高产菌287-53的整合位点，证实为单交换同源重组。在传代复筛实验中，重组高产菌287-53在补加了丙酰基前体01的情况下，F4、F5两代发酵液的生物效价比出发菌株分别高30.61％和93.74％，发酵液中MDMA1组分含量（外标法）分别提高59.34％和42.44％。而287-53在不补料时发酵液中MDMA1组分的含量与出发菌株基本相同。补料与不补料相比，重组高产菌287-53 F4、F5两代发酵液中MDMA1组分的含量分别提高346％和239％，而出发菌株仅提高192％和152％。与出发菌株相比，补料后发酵液中MDMA1组分的含量更明显的提高说明重组高产菌287-53催化麦迪霉素C-3位羟基氧丙酰化的能力更强，表明麦迪霉素C-3位羟基-O-酰基化酶的表达量可能大大增加。除287-53外，其它高产菌株287-18、287-23、287-36、287-62也均被证实发生了同源单交换，基因组上增加了一个拷贝带有PmerR启动子的mdmB基因，推测这些单交换同源重组子的麦迪霉素生物合成基因簇没有被破坏。经过对200株重组菌的筛选，在7株重组高产菌中，有5株是pSPU287的接合子，经传代复筛后仅得到一株稳定高产菌株287-53，因此得出结论：对于生米卡链霉菌，PmerR启动子的启动能力比PermE*强。重组高产菌287-53的发酵特性研究表明：菌体生长与出发菌株没有明显区别，但发酵周期有所延长，发酵水平提高。

全文目录


中文摘要  11-13
英文摘要  13-15
第一章 前言  15-24
  1.1 麦迪霉素概述  15-16
  1.2 麦迪霉素的生物合成  16-18
  1.3 麦迪霉素生物合成基因的研究进展  18-19
  1.4 麦迪霉素基因工程研究进展  19-20
  1.5 mdmB基因及可能的应用  20-21
  1.6 链霉菌基因转移系统  21-22
  1.7 立题依据  22-24
第二章 实验材料与方法  24-35
  2.1 实验材料  24-30
    2.1.1 菌种  24
    2.1.2 质粒  24
    2.1.3 培养基  24-27
    2.1.4 试剂  27
    2.1.5 溶液  27-29
    2.1.6 仪器  29-30
  2.2 实验方法  30-35
    2.2.1 大肠杆菌质粒 DNA小量提取  30
    2.2.2 大肠杆菌质粒 DNA大量提取  30
    2.2.3 重组质粒的快速鉴定  30
    2.2.4 链霉菌总 DNA的提取  30
    2.2.5 大肠杆菌 DH-5α感受态细胞的制备  30-31
    2.2.6 质粒DNA转化大肠杆菌感受态  31
    2.2.7 DNA酶切和连接  31
    2.2.8 DNA琼脂糖凝胶电泳  31
    2.2.9 PCR反应  31-32
    2.2.10 接合转移实验  32
    2.2.11 生米卡链霉菌原生质体的制备方法  32-33
    2.2.12 生米卡链霉菌原生质体再生的方法  33
    2.2.13 质粒转化原生质体  33
    2.2.14 生米卡链霉菌发酵及产物检测实验方法  33-35
第三章 实验结果与讨论  35-63
  第一部分 生米卡链霉菌基因转移系统的建立  35-43
    3.1.1 原生质体转化  35-38
      3.1.1.1 生米卡链霉菌的基础抗药性考察  35
      3.1.1.2 生米卡链霉菌原生质体的制备和再生  35-37
        3.1.1.2.1 菌丝生长条件考察  35-36
        3.1.1.2.2 溶菌酶对原生质体形成和再生的影响  36
        3.1.1.2.3 再生培养基的考察  36-37
      3.1.1.3 DNase的灭活方法  37-38
      3.1.1.4 内源性质粒  38
      3.1.1.5 限制-修饰系统  38
    3.1.2 接合转移系统的建立  38-41
      3.1.2.1 大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒载体类型的选择  38-39
      3.1.2.2 启动子的选择  39
      3.1.2.3 载体抗性标记的选择  39-40
      3.1.2.4 预萌发时间的考察  40
      3.1.2.5 接合转移系统条件的优化  40
      3.1.2.6 重组子的获得及验证  40-41
    3.1.3 讨论  41-43
  第二部分 带有mdmB基因的表达型大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的构建  43-52
    3.2.1 mdmB基因的克隆和亚克隆  43-44
    3.2.2 以pKC1139为载体的表达型质粒pSPU271、pSPU277的构建  44-47
    3.2.3 以pSET152为载体的表达型质粒pSPU287、pSPU281的构建  47-49
    3.2.4 接合子的获得  49-52
  第三部分 重组高产菌株的筛选及mdmB基因的表达  52-63
    3.3.1 重组高产菌株的筛选  52-55
      3.3.1.1 发酵流程  52
      3.3.1.2 筛选指标  52-53
      3.3.1.3 重组高产菌株的筛选  53
      3.3.1.4 七株重组高产菌的传代复筛  53-55
    3.3.2 重组高产菌287-53的同源重组证明  55-56
    3.3.3 其它重组高产菌的整合情况的考察  56
    3.3.4 HPLC法对重组高产菌287-53发酵液组分的考察  56-57
    3.3.5 mdmB基因表达验证  57-58
    3.3.6 重组高产菌287-53的整合稳定性考察  58-59
    3.3.7 重组高产菌287-53的补料优化实验  59-60
    3.3.8 重组高产菌287-53菌体生长和生物效价的考察  60-61
    3.3.9 讨论  61-63
第四章 结论  63-64
参考文献  64-69
致谢  69-70
附录  70-73

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学
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