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基质金属蛋白酶抑制剂分子生物色谱筛选方法的研究和应用

作　者: 梁伟娜
导　师: 王唯红
学　校: 山东大学
专　业: 药物分析
关键词: 基质金属蛋白酶明胶酶抑制剂分子生物色谱固定化酶反应器整体柱药物筛选
分类号: R91
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究背景:恶性肿瘤能浸润其它组织并形成瘤块,是引起人类死亡的重大疾病之一。研究发现,肿瘤细胞产生和释放多种水解酶降解细胞外基质（ECM）或基底膜（BM）可能是浸润与转移的主要内容。在这些水解酶中,基质金属蛋白酶（MMPs）尤其是明胶酶A和B（MMP-2,-9）起到关键作用。明胶酶参与调控ECM的更新,维持细胞的稳定性,已被证明参与肿瘤发生、发展的多个环节,抑制该酶活性就能有效地控制肿瘤发生、发展和转移。所以,以明胶酶为靶点来设计、合成明胶酶抑制剂已经成为抗癌药物研究的热点课题。目前存在的筛选MMPs抑制剂的方法以检测酶活性为主,但是一些传统方法如酶谱分析法、免疫分析法、荧光底物分析法等存在不可避免的缺点,不适合大量、多组分化合物的筛选。与此同时,组合化学技术大大加快了药物及其先导化合物的合成速度,所以,建立一个简便快速的筛选平台势在必行。鉴于以上原因,本文建立了固定化明胶酶分子生物色谱法,并应用于一批化合物的初步筛选。实验方法:分别选择色谱硅胶、整体柱为两种载体,制备固定化明胶酶反应器。以硅胶为载体的固定化明胶酶反应器的制备:L₈（2⁷）正交试验考察固定化明胶酶的制备条件,考察因素包括明胶酶浓度、明胶酶量、缓冲溶液浓度以及pH,考察指标为键合率、酶活性,之后考察固定化明胶酶最佳活性条件。在柱上经键合、冲洗、饱和,将明胶酶键合到分别含环氧基或醛基的色谱硅胶上,计算键合率。进样底物,通过接取流出液比色和加入抑制剂比较产物峰面积变化两种方法确定产物峰的位置,考察流速对产物的影响,测定酶的特征参数——Km,考察柱子的稳定性。以整体柱为载体的固定化明胶酶反应器的制备:采用溶胶-凝胶法,TMOS为硅胶原料,PEG为相分离促进剂,乙酸、氨水和DMF分别作为水解催化剂、中孔制孔剂和干燥控制剂制备整体柱。从凝胶化时间、TMOS/PEG、制孔剂浓度和陈化时间等方面考察制备工艺,以骨架和通孔尺寸、中孔尺寸、硅羟基含量等作为考察指标。经聚四氟乙烯包覆安装于色谱系统中,测得孔隙率。再通过环氧基或醛基偶联将明胶酶键合到整体柱上,进样底物,确定产物峰的位置,考察酶浓度对键合率影响、流速对产物的影响,测定其Km,考察柱子稳定性。筛选抑制剂:以LY52为阳性对照,用以上建立的方法测定其IC₅₀,与文献值和比色法测定值比较,同时制作量-效曲线,验证筛选模型的可行性,并考察精密度。用该两种色谱法测定另外439个化合物的IC₅₀,并与比色法比较。实验结果:正交设计试验所得固定化明胶酶制备条件为:明胶酶0.5mg/mL,缓冲液0.05mol/L,pH6.0,固定化明胶酶最佳活性条件为:底物300μl、pH8.5、42℃。明胶酶与硅胶反应的键合率分别为28.6mg/g（环氧基）、68.4 mg/g（醛基）。确定保留时间为37.631min的峰为产物峰,最佳流速为0.2mL/min,Km分别为0.63±0.006mmol/L（环氧基）、0.54±0.012mmol/L（醛基）,柱子在一周内稳定。综合比较键合率、Km、稳定性发现,醛基为活性基团制备固定化酶反应器更好。溶胶-凝胶法制备整体柱的条件为:TMOS/PEG3.77;120℃1.0mol/L氨水处理:陈化一天,所得整体柱骨架尺寸1.3μm、通孔尺寸2.5μm、中孔尺寸14nm、比表面积264m²/g、硅羟基0.2377 mmol/g、孔隙率81%。明胶酶与整体柱键合,酶浓度以0.3mg/mL最佳,键合率分别为88.6mg/g（环氧基）、90.4 mg/g（醛基）。确定37.409min峰为产物峰,最佳流速为0.2mL/min,Km分别为0.28±0.005mmol/L（环氧基）、0.21±0.008mmol/L（醛基）,柱子在一个月内稳定。综合比较键合率、Km、稳定性发现,两种活性基团差别不大,因环氧基制备简单,选择环氧基偶联整体柱制备固定化酶反应器。色谱法测定LY52的IC₅₀分别为0.018±0.0001μmol/L（色谱硅胶）、0.021±0.0001μmol/L（整体柱）,比色法测得值和文献值分别为0.023±0.0004μmol/L、0.027±0.0004μmol/L,三者基本一致,量-效关系也良好,表明筛选模型是可行的。对另外39个化合物,两种色谱法和比色法测定结果整体趋势保持一致,但总体上以硅胶为载体的色谱法结果略微偏高,整体柱为载体的色谱法筛选效果更好。结论:本文分别以色谱硅胶、硅胶整体柱——两种载体建立的筛选方法是可行的,能够实现对大量多组分化合物快速筛选。

全文目录

中文摘要  8-11
ABSTRACT  11-14
符号说明  14-15
前言  15-31
  1.基质金属蛋白酶  15-21
    1.1 MMPs分类、调节与功能  15-19
    1.2 MMPs水解底物机理  19-21
  2.基质金属蛋白酶抑制剂  21-23
    2.1 MMPIs的分类  21-22
    2.2 异羟肟酸类MMPIs  22-23
  3.基质金属蛋白酶及其抑制剂的活性测定方法  23-31
    3.1 传统方法  23-24
    3.2 分子生物色谱法  24-31
第一章以硅胶为载体的固定化明胶酶反应器筛选明胶酶抑制剂  31-63
  仪器与试剂  32-33
    1.仪器  32-33
    2.材料  33
  方法与结果  33-63
    1.游离明胶酶动力学性质的考察  33-37
      1.1 酰化明胶的制备和浓度测定  33-34
      1.2 明胶酶动力学性质的考察  34-37
      1.3 讨论  37
    2.以硅胶为载体的明胶酶硅胶固定相制备条件的考察  37-45
      2.1 环氧化硅胶的制备  37-38
      2.2.正交试验确定固定化最佳条件  38-40
      2.3 考察固定化明胶酶最佳活性条件  40-44
      2.4 讨论  44-45
    3.制备固定化明胶酶反应器  45-53
      3.1 含活性基团中间体的制备  45-47
      3.2 明胶酶色谱柱的制备  47-48
      3.3 固定化明胶酶最佳活性条件考察  48-51
      3.4 讨论  51-53
    4 筛选抑制剂  53-63
      4.1 筛选模型的可行性验证  53-56
      4.2 分子生物色谱法筛选抑制剂  56-61
      4.3 讨论  61-63
第二章以硅胶整体柱为载体的固定化酶反应器筛选明胶酶抑制剂  63-91
  仪器与材料  65-66
    1.仪器  65
    2.材料  65-66
  方法与结果  66-91
    1.硅胶整体柱制备工艺的考察  66-76
      1.1 凝胶点  66-67
      1.2 玻璃管规格  67
      1.3 TMOS/PEG比例  67-70
      1.4 制孔剂浓度和处理温度  70-72
      1.5 陈化时间  72-73
      1.6 讨论  73-76
    2.硅胶整体柱的包覆和孔隙率的测定  76-79
      2.1 硅胶整体柱的包覆  76-77
      2.2 孔隙率的测定  77-78
      2.3 讨论  78-79
    3.以硅胶整体柱为载体的固定化酶反应器的制备  79-85
      3.1 含活性基团中间体的制备  79-80
      3.2 明胶酶色谱柱的制备  80-81
      3.3 固定化明胶酶最佳活性条件的考察  81-84
      3.4 讨论  84-85
    4.筛选抑制剂  85-91
      4.1 验证筛选模型的可行性  86-87
      4.2 分子生物色谱法筛选抑制剂  87-89
      4.3 讨论  89-91
全文总结  91-93
展望  93-94
参考文献  94-101
附录  101-111
致谢  111-112
攻读学位期间发表的学术论文  112-126
学位论文评阅及答辩情况表  126

基质金属蛋白酶抑制剂分子生物色谱筛选方法的研究和应用

内容摘要

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