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化学—酶法制备普瑞巴林手性中间体的研究

作　者: 曹凤
导　师: 陈敬华
学　校: 江南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 普瑞巴林化学-酶法异丁基丁二腈 (S)-3-氰基-5-甲基己酸假单胞菌
分类号: R914.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

普瑞巴林（Pregabalin），化学名（S）-3-氨甲基-5-甲基己酸，是美国辉瑞公司研制开发的一种氨基丁酸（GABA）受体激动剂，临床用于抗神经痛、焦虑症以及成人部分癫痫症的辅助治疗。目前，在众多普瑞巴林合成路线中，化学-酶法将传统化学方法与现代生物催化法将结合，成为近年来制备普瑞巴林的研究热点之一。（S）-3-氰基-5-甲基己酸是化学-腈水解酶法合成普瑞巴林的关键手性中间体，以异丁基丁二腈（IBSN）为底物，通过产腈水解酶微生物的选择性催化，可制备（S）-3-氰基-5-甲基己酸。首先，本文通过化学合成法制备腈水解酶选择性催化的底物IBSN，以异戊醛和氰基乙酸乙酯为原料，经Knoevenagel缩合、氰基加成及高温脱羧三步反应合成IBSN；通过对原料配比、反应温度、反应时间等反应条件的影响进行考察和优化，总收率由一锅法的62.3%提高至81.4%。通过¹H NMR、¹³C NMR、MS、FT-IR对反应产物的结构进行了表征，确认了其结构的正确性。其次，以外消旋体异丁基丁二腈（IBSN）为底物，通过氯化钴显色法初筛、苯酚-次氯酸钠显色法复筛，最后通过手性气相色谱法终选，最终筛选到一株能够将IBSN选择性催化为（S）-3-氰基-5-甲基己酸的菌株，经鉴定为假单胞菌，并命名为Pseudomonas8，同时，通过¹H NMR、¹³C NMR、HMQC、FT-IR以及MS对催化产物进行结构确认。最后，对Pseudomonas8选择性催化IBSN条件进行了研究，系统地考察了催化反应中的温度、时间、缓冲液pH、菌体浓度、底物浓度、表面活性剂、有机助溶剂等因素对催化反应的影响，得出以下结论：该腈水解酶选择性催化反应的最佳条件为20mM底物浓度，2.0g/L（干细胞重，DCW）菌体浓度、添加5%（w/v）表面活性剂TritonX-100至pH为7.0的PBS缓冲液中，30℃，反应12h，转化率和eep值分别达到57%和67%。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
第一章绪论  9-23
  1.1 课题研究背景  9
  1.2 普瑞巴林简介  9-10
  1.3 普瑞巴林的市场前景  10
  1.4 普瑞巴林的合成国内外研究进展  10-20
    1.4.1 全化学合成法制备普瑞巴林  11-14
    1.4.2 化学-酶法合成普瑞巴林  14-19
    1.4.3 普瑞巴林合成方法的比较  19-20
  1.5 本课题的研究思路  20-23
第二章异丁基丁二腈的合成及反应条件优化  23-33
  2.1 引言  23-24
  2.2 实验材料  24-25
    2.2.1 主要试剂  24
    2.2.2 实验仪器  24-25
  2.3 方法  25-27
    2.3.1 分析方法  25
    2.3.2 5-甲基-2-氰基-2-己烯酸乙酯(Ⅰ)的合成  25-26
    2.3.3 5-甲基-2, 3-二氰基己酸乙酯(Ⅱ)的合成  26
    2.3.4 异丁基丁二腈(Ⅲ)的合成  26-27
  2.4 结果与讨论  27-31
    2.4.1 影响合成 5-甲基-2-氰基-2-己烯酸乙酯(Ⅰ)的因素  27-29
    2.4.2 影响合成 5-甲基-2,3-二氰基己酸乙酯(Ⅱ)的因素  29-30
    2.4.3 影响合成异丁基丁二腈(Ⅲ)的因素  30-31
  2.5 本章小结  31-33
第三章选择性水解异丁基丁二腈菌株的筛选及鉴定  33-53
  3.1 引言  33
  3.2 实验材料  33-36
    3.2.1 菌种来源  33
    3.2.2 试剂  33-34
    3.2.3 主要仪器  34-35
    3.2.4 培养基  35-36
    3.2.5 缓冲液  36
  3.3 菌种筛选  36-39
    3.3.1 菌种的分离纯化与保种  36
    3.3.2 菌种初筛  36-38
    3.3.3 菌种复筛  38-39
    3.3.4 菌种终选  39
  3.4 产物的分离纯化与结构鉴定  39-40
  3.5 菌种鉴定  40-42
    3.5.1 菌体形态特征  40-41
    3.5.2 菌种 16S rRNA 序列鉴定  41-42
  3.6 分析与计算方法  42-43
    3.6.1 分析方法  42-43
    3.6.2 转化率和产物 ee 值计算方法  43
  3.7 结果与讨论  43-51
    3.7.1 菌种筛选结果  43-45
    3.7.2 产物的分离纯化与结构鉴定  45-47
    3.7.3 菌种鉴定结果  47-51
  3.8 本章小结  51-53
第四章目标菌选择性水解异丁基丁二腈条件的研究  53-63
  4.1 引言  53
  4.2 实验材料  53-54
    4.2.1 试剂  53-54
    4.2.2 主要仪器  54
    4.2.3 培养基  54
  4.3 方法  54-57
    4.3.1 Pseudomonas 8 生长曲线的绘制  54-55
    4.3.2 Pseudomonas 8 菌体的培养与收集  55
    4.3.3 Pseudomonas 8 生物量的测定  55-56
    4.3.4 Pseudomonas 8 催化反应  56
    4.3.5 分析与计算方法  56-57
  4.4 结果与讨论  57-62
    4.4.1 反应温度对催化反应的影响  57
    4.4.2 pH 对催化反应的影响  57-58
    4.4.3 底物浓度对催化反应的影响  58-59
    4.4.4 菌体浓度对催化反应的影响  59-60
    4.4.5 添加剂对催化反应的影响  60-61
    4.4.6 催化反应的反应时间进程  61-62
  4.5 本章小结  62-63
第五章结论与展望  63-65
  5.1 结论  63-64
  5.2 展望  64-65
致谢  65-67
参考文献  67-75
附录  75-85
硕士期间发表论文  85

化学—酶法制备普瑞巴林手性中间体的研究

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