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抗锌细菌的筛选与其相关基因的克隆

作　者: 刘义
导　师: 何钢；陈介南
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 抗Zn 铜绿假单胞菌 czc基因 16s rRNA
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

随着工业时代的发展,人源性排放已成为环境锌污染的主要来源。这不但破坏了生态系统的稳定,更经食物链富集,对人类健康造成了严重的威胁。从株洲冶炼集团有限责任公司厂区内部根际土壤筛选到了3株抗Zn细菌编号分别为2-69、2-43和2-21,经16s rDNA基因序列分析,确定菌株2-69和菌株2-43为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。并研究了菌株2-69的最大Zn2+抑制浓度及Zn2+浓度、温度、pH对细菌吸附性的影响。确定了最大抑制浓度为14mmol/L,最适吸附条件：Zn2+浓度比较低,温度36℃,pH值6.6左右。铜绿假单胞菌是锌抗性基因位于染色体上的主要代表性菌株,在自然界分布广泛,为土壤中存在的最常见的细菌之一,对重金属离子也具有很高的抗性水平。其抗锌基因编码蛋白与R. eutropha中czc基因编码的蛋白很相似。本实验就从该菌中克隆到czc基因并力图导入大肠杆菌TOP10中表达进行功能验证,以期最后为能顺利导入杨树中进行植物治理环境污染作好铺垫。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章绪论  9-22
  1.1 锌污染概况  9-11
  1.2 锌污染治理的研究进展  11-13
  1.3 耐锌微生物的研究目的及意义  13-14
  1.4 微生物富锌的机理  14-18
    1.4.1 耐锌菌株的锌抗性机制  14-15
    1.4.2 锌抗性基因的结构和表达  15-18
      1.4.2.1 位于质粒上的锌抗性基因结构和表达  15-16
      1.4.2.2 位于染色体上的锌抗性基因结构和表达  16-18
  1.5 富Zn微生物的培养方法  18-19
  1.6 抗重金属基因的功能分析  19
  1.7 展望  19-20
  1.8 本研究的目的意义  20-21
  1.9 本研究的主要内容和技术路线  21-22
第二章高效富集重金属Zn的细菌菌株筛选  22-26
  2.1 材料与方法  22-23
    2.1.1 材料  22
      2.1.1.1 样品采集  22
      2.1.1.2 培养基  22
      2.1.1.3 实验仪器  22
    2.1.2 方法(抗性菌株筛选)  22-23
      2.1.2.1 富集  22-23
      2.1.2.2 抗性菌株筛选  23
  2.2 实验结果与分析  23-24
    2.2.1 实验结果  23-24
    2.2.2 结果分析  24
  2.3 小结与讨论  24-26
第三章理化性质测定  26-38
  3.1 实验材料  26
    3.1.1 实验仪器  26
    3.1.2 菌株  26
    3.1.3 培养基  26
  3.2 菌株2-69、2-43和2-21的生长曲线  26-27
  3.3 菌株2-69、2-43和2-21耐受性实验  27
    3.3.1 不同pH对筛选菌株生长影响的实验  27
    3.3.2 不同温度对筛选菌株生长影响的实验  27
    3.3.3 不同Zn~(2+)浓度、pH、温度对筛选菌株生长影响的实验  27
  3.4 菌株2-69、2-43和2-21的吸附性实验  27-29
    3.4.1 标准曲线的绘制  28
    3.4.2 吸附曲线  28
    3.4.3 不同Zn~(2+)浓度、pH、温度对筛选菌株吸附性影响的实验  28-29
  3.5 实验结果及分析  29-37
    3.5.1 菌株2-69、2-43和2-21的生长曲线  29-30
    3.5.2 菌株2-69、2-43和2-21耐受性实验  30-34
      3.5.2.1 不同pH对筛选菌株生长影响的实验  30
      3.5.2.2 不同温度对筛选菌株生长影响的实验  30-31
      3.5.2.3 不同Zn~(2+)、温度、pH对筛选菌株生长影响的实验  31-34
    3.5.3 菌株2-69、2-43和2-21的吸附性实验  34-37
      3.5.3.1 标准曲线的绘制  34
      3.5.3.2 吸附曲线  34-35
      3.5.3.3 不同Zn~(2+)浓度、pH、温度对筛选菌株吸附性影响的实验  35-37
  3.6 小结与讨论  37-38
第四章高效富集重金属Zn的细菌菌种鉴定  38-48
  4.1 实验材料  38-41
    4.1.1 实验仪器  38
    4.1.2 菌株  38
    4.1.3 工具酶及主要试剂  38
    4.1.4 培养基  38-39
      4.1.4.1 LB液体培养基  38-39
      4.1.4.2 LB固体培养基  39
    4.1.5 试剂及溶液  39-41
  4.2 实验方法  41-43
    4.2.1 菌种生理生化鉴定  41
      4.2.1.1 革兰氏染色  41
    4.2.2 菌种分子鉴定  41-43
      4.2.2.1 菌株2-69和2-43总DNA提取  41
      4.2.2.2 菌株2-69和2-43 16s rDNA扩增  41-42
      4.2.2.3 菌株2-69和2-43扩增产物的纯化  42
      4.2.2.4 菌株2-69和2-43重组质粒的构建和鉴定  42-43
      4.2.2.5 菌株2-69和2-43 16s rDNA序列测定与分析  43
  4.3 实验结果与分析  43-46
    4.3.1 形态观察和细胞大小鉴定  43-44
    4.3.2 菌种分子鉴定  44-46
      4.3.2.1 菌株2-69和2-43总DNA提取  44
      4.3.2.2 菌株2-69和2-43 16s rDNA扩增  44
      4.3.2.3 菌株2-69和2-43重组质粒的构建和鉴定  44
      4.3.2.4 菌株2-69和2-43 16s rDNA序列测定与分析  44-46
  4.4 小结与讨论  46-48
第五章 czc基因克隆  48-60
  5.1 实验材料  48-51
    5.1.1 实验仪器  48
    5.1.2 菌株  48
    5.1.3 工具酶及主要试剂  48
    5.1.4 培养基  48-49
      5.1.4.1 LB液体培养基  48-49
      5.1.4.2 LB固体培养基  49
    5.1.5 试剂及溶液  49-51
  5.2 实验方法  51-55
    5.2.1 铜绿假单胞菌的总DNA提取  52
    5.2.2 czc基因的引物设计  52
    5.2.3 czc基因的扩增  52-53
    5.2.4 czc基因扩增产物的纯化  53
    5.2.5 重组质粒的构建和鉴定  53
    5.2.6 czc基因序列测定与分析  53-54
    5.2.7 酶切重组T载体  54-55
  5.3 实验结果与分析  55-58
    5.3.1 总DNA提取  55
    5.3.2 czcCB、czcA基因扩增结果  55
    5.3.3 重组质粒验证  55
    5.3.4 czc基因测序结果  55-58
  5.4 小结与讨论  58-60
第六章结论与展望  60-62
  6.1 结论  60
  6.2 本论文的主要创新点  60
  6.3 建议  60-62
参考文献  62-68
附录A:表达载体pUC-18图谱  68-69
附录B:菌株2-43的16s rDNA基因片段测序报告(SP6)  69
附录C:菌株2-69的czc基因片段测序报告(SP6)  69-70
附录D:GenBank中登录czc基因的网页  70-74
附录E:缩略词表  74-76
附录F:攻读硕士研究生期间的科研成果  76-77
致谢  77

抗锌细菌的筛选与其相关基因的克隆

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