学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

fmo同源基因在绿僵菌生长、发育及致病过程中的作用研究

作　者: 汪雅琴
导　师: 余瑛
学　校: 重庆理工大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 黄素单加氧酶绿僵菌同源性基因敲除毒力生长发育抗逆
分类号: R915
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 7次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

黄素单加氧酶(monooxygenase FAD-binding，FMO)普遍存在于哺乳动物组织的内质网，能广泛的氧化含硫和含氮的外源性物质，代谢有毒或者致癌性物质，有解毒功能。然而目前对FMO在丝状真菌中的作用尚不清楚，本实验室在前期研究中发现，绿僵菌中有一fmo同源基因在绿僵菌侵染宿主后在宿主体内能高表达，可能与侵染毒力相关。研究绿僵菌fmo（Mafmo）基因功能不仅有助于进一步明确真菌的致病机制，同时也为筛选新的抗真菌药物或高毒力菌株提供理论依据。本研究运用基因敲除技术构建Mafmo敲除载体获得稳定的敲除菌株(ΔMafmo)，分析了Mafmo基因对绿僵菌侵染毒力、生长发育及抗逆性的影响。主要研究内容：1. Mafmo序列的生物信息学分析从实验室构建的绿僵菌在宿主体内特异表达基因的差减文库中选择编号为CJY1439的EST序列,在NCBI上进行Blastx比对，分析该序列与其他基因的同源性；采用nucleotide blasts搜索出CJY1439对应的基因组序列；用GENSCAN1.0和GeneMark预测其氨基酸序列。2.获得Mafmo基因的敲除菌株设计引物，从野生型绿僵菌Ma102基因组DNA中扩增出Mafmo的左、右臂DNA片段，分别插入pK2-PB载体Bar基因的5端或3端，构建Mafmo的敲除载体。采用农杆菌介导转化法产生Mafmo基因的敲除菌株。通过PCR分析和Southern blotting的方法鉴定Mafmo基因的敲除菌株。3. Mafmo基因的功能分析⑴Mafmo基因对毒力的影响将Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鲜孢子配制成的孢悬液，分别采用体内注射或体表侵染两种途径研究Mafmo敲除菌株与野生型菌株对宿主毒力的作用。通过观察经过两种途径处理后宿主的死亡时间，分析半致死时间的变化，以明确Mafmo基因对毒力的影响。⑵Mafmo基因在绿僵菌侵染中的作用①Mafmo基因对绿僵菌在宿主血腔中生长的影响活体观察：将Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鲜孢子配制成的孢悬液通过体内注射宿主后，取宿主血液观察虫菌体数量。离体观察：取新鲜的宿主血液，去除或不去除血细胞，分别接种Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鲜孢子配置成的孢悬液，观察孢子萌发、生长情况。②Mafmo基因在绿僵菌侵染初期的作用孢子萌发及附着胞形态的观察：将Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鲜孢子配制成的孢悬液分别接种于宿主后翅，观察孢子萌发及侵染结构附着胞的形成时间，分析两者之间是否存在差异。⑶Mafmo基因对绿僵菌抗逆生长的影响在高渗透压（0.4MKCl，1M山梨醇，1M甘露醇）、高氧化剂（30%H2O2）、细胞壁干扰剂（50μg/mL荧光增白剂，500μg/mL刚果红，0.01%十二烷基磺酸钠）或缺氧条件下培养Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鲜孢子配制成的孢悬液，观察其在形态、产孢量、生物量积累的差异。主要研究结果：1. EST序列编号为CJY1439，长度710bp。Blastx比对发现CJY1439对应的基因组序列与monooxygenase FAD-binding (FMO)有同源性，因此将此基因命名为Mafmo。该基因编码193个氨基酸，分子量为21.8kDa，等电点pI为8.14，不含有信号肽。2.通过PCR分析和Southern blotting鉴定，证实获得了4个稳定的Mafmo敲除菌株（△Mafmo1、△Mafmo3、△Mafmo5、△Mafmo6）。3. Mafmo基因的功能分析结果：⑴生物毒力测定结果显示：体内注射孢悬液后，Mafmo敲除菌株较野生型菌株对宿主的半致死时间显著提前（Mafmo敲除菌株对宿主的半致死时间为：△Mafmo3的为3.83±0.10d；△Mafmo5的为3.59±0.13d；△Mafmo6的为3.23±0.21d，野生型菌株对宿主的半致死时间为：4.99±0.17d）；体表侵染孢悬液后，Mafmo敲除菌株和野生型菌株二者对宿主的的半致死时间没有显著差异。结果表明Mafmo基因影响绿僵菌的毒力。⑵①活体血液培养结果显示：野生型菌株或Mafmo敲除菌株新鲜孢子配制成的孢悬液通过体内注射进入宿主体内后，取宿主血液观察发现Mafmo敲除菌株较野生型菌株产生的虫菌体不仅出现的早且多，数量差异显著；离体血液培养结果显示：全血培养36h时间后，野生型菌株较Mafmo敲除菌株在菌体数上要少，差异显著；用不含血细胞的血液离体培养，野生型菌株与Mafmo敲除菌株在菌体数上无显著差异。②将Mafmo敲除菌株或野生型菌株新鲜孢子配制成的孢悬液分别接种于宿主后翅上，20h时野生型菌株的萌发率显著高于Mafmo敲除菌株；二者的附着胞相对形成率却没有显著差异。即Mafmo影响绿僵菌在宿主体表的萌发不影响其附着胞的形成。以上①、②表明：Mafmo基因不仅在绿僵菌进入宿主血腔后具有功能活性，还影响了绿僵菌侵染初期的生长发育。⑶在高渗透压、高氧化剂、干扰剂和缺氧条件下培养Mafmo敲除菌株与野生型菌株，二者在形态、产孢量、生物量积累上表现出显著差异。结果表明Mafmo基因影响绿僵菌在逆境条件下的生长发育。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-12
英文缩写一览表  12-13
绪论  13-19
  Ⅰ 真菌侵染机制的研究进展  13-15
  Ⅱ FMO 的结构与功能  15-16
  Ⅲ 研究内容与技术路线  16-19
    研究内容  16-17
    技术路线  17-19
1 材料与方法  19-33
  1.1 材料  19-21
    1.1.1 主要供试菌株及昆虫  19
    1.1.2 主要仪器设备  19-20
    1.1.3 主要试剂及试剂盒  20
    1.1.4 主要培养基及溶液  20-21
  1.2 方法  21-33
    1.2.1 Mafmo 序列的生物信息学分析  21
    1.2.2 Mafmo 基因敲除载体的构建  21-24
    1.2.3 农杆菌介导的遗传转化  24-25
    1.2.4 Mafmo 敲除菌株的筛选  25-26
    1.2.5 Mafmo 基因对毒力的影响  26-27
    1.2.6 Mafmo 基因在绿僵菌侵染中的作用  27-29
    1.2.7 逆境条件下 Mafmo 基因对绿僵菌的影响  29-30
    1.2.8 Mafmo 基因对绿僵菌体外萌发率的影响  30
    1.2.9 Mafmo 基因对绿僵菌产孢量的影响  30-31
    1.2.10 Mafmo 基因对绿僵菌生物量的影响  31-33
2 结果与分析  33-45
  2.1 Mafmo 序列的生物信息学分析  33
    2.1.1 同源比对  33
    2.1.2 编码氨基酸序列的预测  33
    2.1.3 结构预测  33
  2.2 Mafmo 基因敲除载体的构建及敲除菌株的筛选  33-34
  2.3 Mafmo 基因的功能分析  34-45
    2.3.1 Mafmo 基因对毒力的影响  34-36
    2.3.2 Mafmo 基因在绿僵菌侵染中的作用  36-39
    2.3.3 逆境条件下 Mafmo 基因对绿僵菌的影响  39-42
    2.3.4 Mafmo 基因对绿僵菌体外萌发率的影响  42-43
    2.3.5 Mafmo 基因对绿僵菌产孢量的影响  43-44
    2.3.6 Mafmo 基因对绿僵菌生物量的影响  44-45
3 讨论  45-47
  3.1 基因敲除技术  45
  3.2 Mafmo 基因在绿僵菌生长、发育及致病过程中的作用  45-46
  3.3 本研究创新之处  46-47
4 全文总结与研究展望  47-49
  4.1 全文总结  47-48
  4.2 研究展望  48-49
致谢  49-51
参考文献  51-55
附录 Mafmo 的 EST 序列  55-56
个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果  56

fmo同源基因在绿僵菌生长、发育及致病过程中的作用研究

内容摘要

全文目录

相似论文