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HMGA2促进胃癌上皮细胞间质转化分子机制研究

作　者: 查郎
导　师: 王子卫
学　校: 重庆医科大学
专　业: 外科学
关键词: HMGA2 上皮细胞间质转化胃癌
分类号: R735.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景和目的：胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在过去的20年中其死亡率虽然明显降低，但是在我国其发病率和死亡率仍然位于恶性肿瘤的前列，而肿瘤的转移是治疗失败的主要原因。迁移和侵袭是胃癌细胞转移的关键步骤。近年来，上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)成为肿瘤转移的研究热点。EMT是一种常见的生理病理现象，与胚胎发育、伤口愈合及肿瘤侵袭转移等过程密切相关，主要表现为上皮细胞失去极性，细胞之间紧密连接和黏附连接下降，而获得了浸润性和游走迁移能力，演变为具有间质细胞形态和特性的细胞。因此，通过对胃癌细胞EMT的分子机制的研究，不仅能对胃癌转移的生物学行为提供新的研究方向，甚至能为胃癌的治疗提供潜在的策略。HMGA2（High mobility group protein A2）是一种非组蛋白染色体蛋白，本身没有转录活性，但是可以通过改变染色质结构调节其他基因的转录。HMGA2在正常组织中低表达或不表达，而在在胚胎形成时和恶性肿瘤组织中表达明显上调。在一些恶性肿瘤中HMGA2可以作为诊断的分子标志物或判断预后的独立因素。此外，HMGA2能促进上皮细胞间质化及维持肿瘤干细胞分化潜能和自我更新的能力，在肿瘤的形成、增殖及转移方面可能发挥重要作用。本研究首先在胃癌组织中检测HMGA2的表达并分析它与对应的胃癌病人临床病理参数之间的关系；其次，构建HMGA2过表达的慢病毒载体，转染内源性HMGA2低表达的胃癌细胞株，建立稳定过表达HMGA2的胃癌细胞株；合成HMGA2的siRNA的干扰片段，瞬时转染内源性高表达HMGA2的胃癌细胞株；分别检测干扰或过表达前后细胞生物学和分子生物学指标的改变。最后，筛选HMGA2下游可能的靶基因，并在胃癌细胞及动物模型上进行验证。探讨HMGA2促进EMT可能的分子机制。方法：（1）采用免疫组化SP法检测71例胃癌组织中HMGA2的表达，分析其与临床病理参数之间的关系。（2）Western-blot检测不同胃癌细胞株中HMGA2表达情况，构建过表达HMGA2的慢病毒载体，转染内源性低表达的胃癌细胞株并建立稳定株，使用MTT，侵袭小室及软琼脂克隆的方法比较过表达HMGA2后细胞在生长，侵袭转移性，成瘤性等细胞生物学指标的改变。合成HMGA2-siRNA，干扰内源性高表达HMGA2的胃癌细胞，分别检测过表达HMGA2前后与干扰HMGA2前后EMT标志物E-cadherin, N-cadherin和Vimentin的表达水平。建立裸鼠移植瘤模型，利用免疫组化的方法检测低表达HMGA2和过表达HMGA2的移植瘤EMT标志物的表达之间的差别。（3）使用染色质共沉淀加启动子芯片分析（ChIP on chip）鉴定HMGA2下游的直接作用靶点，使用KEGG_PATHWAY分析芯片结果，选取与肿瘤EMT相关的基因或信号通路进行分析，使用ChIP-qPCR（染色质共沉淀加荧光定量PCR），western-blot，qPCR及免疫荧光的方法进行验证。结果：（1）在胃癌组织中HMGA2的表达和胃癌患者淋巴结转移及临床TNM分期相关。（2）成功构建HMGA2过表达的慢病毒载体，外源性的HMGA2蛋白主要表达于细胞核内；转染内源性低表达的胃癌细胞株MKN28和GES-1后增强其迁移，侵袭和体外成瘤能力，但降低其生长率。过表达HMGA2后，胃癌细胞上皮标志物E-cadherin表达降低，间质标志物N-cadherin和Vimentin表达升高，细胞呈现出EMT状态；使用HMGA2-SiRNA干扰内源性高表达的MKN45细胞后，EMT状态出现一定程度的逆转。动物试验中发现，过表达HMGA2的MKN28细胞成瘤能力更强，但是移植瘤的生长速度减慢。（3）ChIP on chip分析发现1366个HMGA2可能的下游靶点，分析芯片结果后选出可能与EMT有关的两个基因TWIST1和AXIN1验证，发现过表达HMGA2可以促进TWIST1的表达，降低AXIN1的表达，使β-catenin进入胞核，进而激活Wnt/β-catenin信号通路。结论：HMGA2在胃癌组织中高表达，且与胃癌的侵润转移相关；胃癌细胞中稳定表达HMGA2可以促进胃癌细胞EMT的发生，增强胃癌细胞的侵袭转移和成瘤能力；胃癌细胞中HMGA2表达的降低可以逆转EMT状态；HMGA2通过上调TWIST1的表达，降低AXIN1的表达，促进使β-catenin进入细胞核，进而激活Wnt/β-catenin信号通路，诱发EMT。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-14
前言  14-18
  参考文献  16-18
第一部分 HMGA2 在胃癌组织中的表达及其临床意义  18-27
  1 材料与方法  18-21
  2 结果  21-23
  3 讨论  23-25
  参考文献  25-27
第二部分 HMGA2 过表达慢病毒载体构建及验证  27-51
  1 材料与方法  28-42
  2 结果  42-46
  3 讨论  46-49
  参考文献  49-51
第三部分 HMGA2 对胃癌细胞分子生物学及细胞生物学特性的影响  51-73
  1 材料与方法  51-60
  2 结果  60-67
  3 讨论  67-70
  参考文献  70-73
第四部分 HMGA2 作用靶点的筛选及其促进上皮细胞间质转化的分子机制  73-96
  1 材料与方法  74-82
  2 结果  82-89
  3 讨论  89-92
  参考文献  92-96
全文总结  96-97
不足之处与展望  97-98
文献综述:恶性肿瘤中高迁移率族蛋白 A2 的研究进展  98-108
  参考文献  105-108
致谢  108-109
攻读学位期间的主要研究成果  109-110

HMGA2促进胃癌上皮细胞间质转化分子机制研究

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