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牙本质基质蛋白1的矿化功能研究

作　者: 王学政
导　师: 韩金祥
学　校: 济南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 牙本质基质蛋白1 融合表达碱性磷酸酶矿化结节生物矿化
分类号: R593.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

牙本质基质蛋白1（Dentin matrix protein1, DMP1）基因位于人类染色体4q21，其编码的蛋白质是一种高度磷酸化的偏酸性非胶原蛋白，由于其拥有较大的酸性结构域，携带大量的负电荷，故与钙离子有较强的结合能力。它在生物体外能够促进羟基磷灰石的形成，并且调控细胞的分化过程；在生物体内能够参与硬组织的矿化过程。DMP1在骨组织与细胞中已被发现主要有4种存在形式，即全长DMP1、37KD N-DMP1、57KD C-DMP1和DMP1-PG，它们的分布位置以及功能作用各不相同,但是对于骨的正常形成都具有十分重要的意义。目前国内外对DMP1主要功能片段以及DMP1影响成骨细胞分化机制的研究仍存在争议。因此，本实验分别扩增出37KD N-末端的DMP1和全长DMP1，分析它们在生物矿化过程中所起的作用。目的:检测DMP1不同功能片段在胞内定位及含有rs10019009SNP位点不同碱基的DMP1对细胞矿化功能的影响。方法:利用定点突变改造DMP1基因，获得DMP1基因的SNP rs10019009的不同基因型，利用PCR技术和双酶切定向克隆方法将含有SNP位点不同碱基的37kDa N-DMP1和全长DMP1基因定向克隆入含增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein, EGFP）的质粒pcDNA3.1-EGFP中，构建重组质粒pcDNA3.1-DMP1-EGFP,通过脂质体法瞬时转染HEK293细胞，荧光显微镜观察重组融合蛋白DMP1-EGFP的表达及胞内定位。采用碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）活性检测的方法检测SAOS-2细胞前后ALP活性变化，采用茜素红染色法观察SAOS-2矿化结节的形成，从而分析DMP1对SAOS-2细胞矿化功能的影响。结果: DNA测序结果表明，定点突变后的DMP1基因的碱基序列与设计序列完全一致；PCR和DNA测序显示重组质粒pcDNA3.1-DMP1-EGFP构建成功，融合蛋白DMP1-EGFP在HEK293细胞中主要表达于细胞的胞浆中。ALP活性检测实验结果表明，DMP1的不同功能片段均能提高SAOS-2细胞的ALP活性，全长的DMP1的重组质粒比N端DMP1的重组质粒的ALP相对活性高，含有rs10019009SNP位点突变的T碱基的DMP1的重组质粒比含有野生型的A碱基的DMP1的重组质粒的ALP活性高。经过抗坏血酸、β-磷酸甘油矿化诱导，通过茜素红染色实验发现含有突变型的T碱基的DMP1重组质粒比含有野生型A碱基的DMP1的重组质粒更能促进矿化结节的生成，全长的的DMP1的重组质粒较N端的DMP1的重组质粒更能促进矿化结节的形成。结论:已成功构建了含rs10019009SNP位点不同碱基的37kDa的N-DMP1和全长的DMP1基因的重组表达质粒，并在HEK293细胞的胞浆中有效地表达，通过ALP活性检测和茜素红染色检测矿化结节实验含有突变型的T碱基的DMP1比含有野生型A碱基的DMP1更能促进细胞的生物矿化，全长的的DMP1较N端的DMP1更能促进细胞的生物矿化，为进一步研究DMP1对生物矿化的作用以及rs10019009SNP位点通过何种机制来参与强直性脊柱炎（ankylosingspondylitis, AS)发病奠定了基础，也为其今后作为靶点治疗AS提供了实验依据。

全文目录

导师简介  5
课题组成员  5-8
摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
主要符号表  13-14
前言  14-17
  1 强直性脊柱炎  14-15
  2 牙本质基质蛋白 1  15-16
  3 碱性磷酸酶  16-17
第一章 DMP1 功能片段表达载体的构建  17-33
  1 材料与方法  17-29
    1.1 材料  17-18
    1.2 方法  18-29
  2 结果  29-31
    2.1 突变产物的鉴定  29
    2.2 重组真核表达质粒 pcDNA3.1-EGFP 的鉴定  29
    2.3 含 SNP 位点不同碱基 N-末端和全长 DMP1 基因扩增产物的鉴定  29-30
    2.4 重组质粒 pcDNA3.1-DMP1-EGFP 的鉴定  30-31
  3 讨论  31-32
  4.小结  32-33
第二章 DMP1 重组表达质粒的融合表达及其胞内定位  33-38
  1 材料与方法  33-36
    1.1 材料  33-34
    1.2 方法  34-36
  2 结果  36-37
    2.1 HEK293 细胞状态良好  36
    2.2 DMP1-EGFP 融合蛋白在 HEK293 细胞中的瞬时表达及定位  36-37
  3 讨论  37
  4 小结  37-38
第三章 DMP1 功能片段对 SAOS-2 细胞 ALP 活性的影响  38-44
  1 材料与方法  38-41
    1.1 材料  38-39
    1.2 方法  39-41
  2 结果  41-42
    2.1 DMP1-EGFP 融合蛋白在 SAOS-2 细胞中的瞬时表达  41
    2.2 ALP 活性测定  41-42
  3 讨论  42-43
  4 小结  43-44
第四章 DMP1 功能片段对 SAOS-2 细胞矿化结节形成的影响  44-51
  1 材料与方法  44-47
    1.1 材料  44-45
    1.2 方法  45-47
  2 结果  47-49
    2.1 DMP1-EGFP 融合蛋白在 SAOS-2 细胞中的瞬时表达  47
    2.2 矿化结节检测  47-48
    2.3 定量分析  48-49
  3 讨论  49-50
  4 小结  50-51
第五章稳定表达 DMP1 不同片段的 SAOS-2 细胞系的建立  51-55
  1 材料与方法  51-53
    1.1 材料  51
    1.2 方法  51-53
  2 结果  53
  3 讨论  53-54
  4 小结  54-55
参考文献  55-59
附录  59-60
综述  60-67
  参考文献  64-67
在校期间发表的论文  67-68
致谢  68

牙本质基质蛋白1的矿化功能研究

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