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猪白细胞介素2/6嵌合基因的融合表达及活性研究

作　者: 马文涛
导　师: 吴志明
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪白介素2 猪白介素6 嵌合基因 融合表达 活性
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


疫苗免疫接种是控制猪传染病的重要手段,但由于疫苗自身的缺点以及免疫抑制病的发生而带来的疫苗免疫失败、免疫保护率低等情况时而发生[1~2]。因此,提高疫苗的免疫力和免疫保护效果对控制猪传染病具有重要意义。细胞因子作为免疫佐剂可以提高疫苗的免疫效果、增强动物机体的免疫力,因此细胞因子作为免疫增强剂的研究成为目前研究的热点。白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-2)分别属于Th1、Th2型细胞因子,介导细胞免疫与体液免疫。大量研究表明,IL-2、IL-6可以作为免疫佐剂增强疫苗的免疫效果。为探讨IL-2/IL-6用作疫苗佐剂的协同免疫增强作用机理及效果,研究高效猪基因工程免疫增强剂获得一种能够平衡Th1和Th2应答的新型、高效的免疫增强剂。本研究从LPS脂多糖刺激过的猪脾脏细胞中提取PoIL-6 RNA,进一步构建rpQE-30/PoIL-6原核表达质粒,对其原核表达的蛋白进行纯化,研究其生物学活性及对脾脏细胞的增殖活性。然后采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)技术将猪白介素-2成熟肽基因(PoIL-2)和猪白介素-6成熟肽基因(PoIL-6)构建成重组嵌合基因(PoIL-2-linker-PoIL-6)并克隆入pGEM-T easy克隆载体;将含PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因的重组克隆阳性质粒经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后与经同样酶切的原核表达载体pQE30粘端连接,筛选阳性重组表达质粒在E.Coil中进行表达。对表达的重组融合蛋白(rPoIL-2-linker-PoIL-6)通过尿素变性、复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化并进行蛋白含量测定。分别检测rPoIL-6、rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白与抗PoIL-2、PoIL-6单抗发生特异性免疫反应及促猪外周血T淋巴细胞、猪脾脏细胞的增殖活性的活性。结果表明:成功克隆了rPoIL-6成熟肽基因,基因全长573bp;并构建成功rpQE-30/PoIL-6原核表达质粒,其在大肠杆菌系统中表达的rPoIL-6蛋白分子量大小约为20KD;经纯化后的蛋白质纯度在95%以上;rPoIL-6蛋白能和抗PoIL-6单抗发生特异性反应,MTS法检测得出,rPoIL-6蛋白活性为1.23x106UI/mg,具有促进猪脾脏细胞的增殖活性。成功构建了PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因及其重组原核表达质粒rpQE-30/PoIL-2-linker-PoIL-6;表达的rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白经纯化后纯度在96%以上。rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白分别可与抗PoIL-2、PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并可显著促进猪外周血T淋巴细胞和猪脾脏细胞的增殖。rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白促猪外周血T淋巴细胞和脾脏淋巴细胞增殖活性也与浓度呈现相关性,相对而言,rPoIL-2-linker-PoIL-6和rPoIL-2蛋白对照具有明显促猪外周血T淋巴细胞增殖所需要的最低浓度较高(最大稀释度分别为1: 256,0.598ug/mL;1: 512,0.322ug/mL),且rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白的促增殖活性稍优于相同稀释度的rPoIL-2蛋白对照。与IL-2的促外周血T细胞增殖活性所需要的蛋白剂量不同,极低浓度(最大稀释度1:214)的rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白、rPoIL6蛋白和rhIL-6蛋白即可刺激猪脾脏淋巴细胞的增殖;相对而言,rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白的促猪脾脏淋巴细胞增殖活性稍优于rPoIL-6蛋白对照,但二者均稍低于rhIL-2标准品。这表明rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白在动物体外具有单rPoIL-2、rPoIL-6蛋白叠加的生物学活性,且其活性可能优于两种单rPoIL-2、rPoIL-6蛋白混合应用。本研究成功构建了rpQE-30/PoIL-6原核表达质粒、PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因及其重组原核表达质粒(rpQE-30/PoIL-2-linker-PoIL-6)。表达的rPoIL-6蛋白能和抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,且具有促进猪脾脏细胞的增殖活性。rPoIL-2-linker-PoIL-6融合蛋白能够显著的促进猪外周血淋巴细胞和猪脾脏细胞的增殖,且在体外具有单rPoIL-2和rPoIL-6蛋白的双重生物学活性,为下一步进行rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白在动物体内活性研究奠定了基础。

全文目录


致谢  4-8摘要  8-10文献综述  10-19  1 白介素-2 研究进展  11-14    1.1 IL-2的发现与命名  11    1.2 IL-2受体的研究  11-12    1.3 IL-2的来源与作用机理  12-13    1.4 IL-2的种属特异性  13    1.5 IL-2的生物学活性  13-14    1.6 IL-2的应用  14  2 白介素-6 的研究进展  14-19    2.1 IL-6的发现与命名  15    2.2 IL-6受体的研究  15-16    2.3 IL-6的来源与作用机理  16-17    2.4 IL-6的生物学活性  17-18    2.5 IL-6作为免疫增强剂的研究  18-19前言  19-20试验一 猪白细胞介素6基因的克隆、表达及活性研究  20-36  1 材料与方法  20-29    1.1 材料  20-22      1.1.1 菌种和质粒  20      1.1.2 主要试剂与试剂盒  20-21      1.1.3 主要溶液的配制  21-22    1.2 方法  22-29      1.2.1 PoIL-6 基因的克隆与表达载体的构建  22-27      1.2.2 PoIL-6基因在大肠杆菌表达系统中的表达及鉴定  27      1.2.3 PoIL-6蛋白的纯化制备  27-28      1.2.4 ELISA 方法检测 rPoIL-6 蛋白免疫反应活性  28      1.2.5 MTS 法检测 rPoIL-6 脾淋巴细胞增殖活性  28-29  2 结果  29-34    2.1 目的基因的 PCR 扩增  29    2.2 DNA 快速回收试剂盒回收 PoIL-6 PCR 产物  29-30    2.3 pGEM-T Easy/ PoIL-6 质粒的 PCR 鉴定和双酶切鉴定  30-31    2.4 pQE30/ PoIL-6 质粒的 PCR 鉴定和双酶切鉴定  31-32    2.5 测序  32    2.6 rPoIL-6蛋白的表达与纯化  32-33    2.7 rPoIL-6 蛋白特异性免疫反应活性检测  33-34    2.8 rPoIL-6 蛋白促猪脾脏淋巴母细胞增殖活性  34  3.结论与讨论  34-36试验二 猪白细胞介素2/6嵌合基因的构建及融合表达  36-49  1 材料与方法  36-43    1.1 材料  36-38      1.1.1 细胞株和质粒  36      1.1.2 主要试剂与试剂盒  36-37      1.1.3 主要溶液的配制  37-38    1.2 方法  38-43      1.2.1 PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因的构建  38-42      1.2.2 PoIL-2-linker-PoIL-6 基因在大肠杆菌表达系统中的融合表达及鉴定  42      1.2.3 PoIL-2-linker-PoIL-6 蛋白的纯化制备  42-43  2 结果  43-47    2.1 PoIL-2-Linker和Linker-PoIL-6基因的扩增  43-44    2.2 目的基因的 PCR 扩增及产物的回收  44    2.3 rpGEM-T Easy/PoIL-2-linker-PoIL-6 质粒的鉴定  44-45    2.4 rpQE30/ PoIL-2-linker-PoIL-6 的质粒鉴定  45-46    2.5 测序结果  46    2.6 PoIL-2-linker-PoIL-6的融合表达与纯化  46-47  3 结论与讨论  47-49试验三 rPoIL-2-linker-PoIL-6 蛋白的体外活性研究  49-56  1 材料与方法  49-51    1.1 材料  49    1.2 方法  49-51      1.2.1 ELISA 方法检测 rPoIL-2-linker-PoIL-6 中的 PoIL-2 蛋白免疫反应活性  49-50      1.2.2 ELISA 方法检测 pQE30/PoIL-2-linker-PoIL-6 中的 PoIL-6 蛋白免疫反应活性  50      1.2.3 MTS 法检测 PoIL-2-linker-PoIL-6 蛋白促猪外周血 T 淋巴细胞增殖活性  50-51      1.2.4 MTS 法检测 PoIL-2-linker-PoIL-6 蛋白促猪脾脏淋巴细胞增殖活性  51  2 结果  51-54    2.1 间接 ELISA 检测重组 PQE30/PoIL-2-linker-PoIL-6 中的 PoIL-2 蛋白活性  51-52    2.2 间接 ELISA 检测重组 PQE30/PoIL-2-linker-PoIL-6 中的 PoIL-6 蛋白活性  52-53    2.3 rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白促猪外周血T淋巴细胞增殖活性  53    2.4 rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白促猪脾脏淋巴细胞增殖活性  53-54  3 结论与讨论  54-56参考文献  56-64Abstract  64-66发表论文  66

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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