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淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响

作　者: 赵弼洲
导　师: 余占海
学　校: 兰州大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 淫羊藿苷人牙周膜细胞原代培养增殖骨向分化碱性磷酸酶骨涎蛋白骨钙素
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：本实验在体外成功原代培养人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)的基础上,将含不同浓度淫羊藿苷(icariin,ICA)的矿化诱导培养液与其作用,通过检测其增殖,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)等骨相关特征性指标,以期明确淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响。方法：1.采用胰酶消化玻片覆盖组织块法体外原代培养人牙周膜细胞,相差倒置显微镜观察其形态学特征,采用每日细胞计数法绘制细胞生长曲线；2.波形丝蛋白、角蛋白免疫细胞化学染色鉴定原代培养的人牙周膜细胞来源；3.在矿化诱导条件下培养人牙周膜细胞21d,行茜素红染色,以是否形成钙化结节评价其是否具有骨向分化能力；4.在矿化诱导条件下将浓度为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0μg/ml的淫羊藿苷与人牙周膜细胞作用24h、48h、72h,采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)评价淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖的影响；5.在矿化诱导条件下将浓度为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0μg/ml的淫羊藿苷与人牙周膜细胞作用72h,通过检测ALP活性,Elisa法检查BSP、OCN的表达水平,评价其对人牙周膜细胞骨向分化的影响。结果：1.胰酶消化玻片覆盖组织块法可成功原代培养人牙周膜细胞,生长曲线可见,接种后24-48h,细胞数目有所减少,第3d细胞开始增殖,逐渐进入指数增殖期,接种后第7d,细胞数目达到最大值,第8d开始,细胞进入平台期。整个生长曲线呈现“S”形。按公式计算,得出细胞倍增时间约为90h。2.原代培养人牙周膜细胞免疫细胞化学染色,波形丝蛋白染色阳性,表现为胞质棕黄色着色；角蛋白染色阴性,未见着色,说明是中胚层来源细胞。3.矿化诱导培养第14d时,观察到细胞群中出现灰白色结节,随时间增长逐渐增大增多。第21d时结束培养行茜素红染色后可见,矿化诱导培养组形成多处红染矿化结节,而对照组仅可见到极少数红染矿化结节,原代培养的人牙周膜细胞可在矿化诱导条件下骨向分化：4.淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖的影响：淫羊藿苷作用24h时,各药物浓度均能促进人牙周膜细胞增殖(P<0.05)。作用48h时,1-0.001μg/ml组可明显增强人牙周膜细胞增殖能力(P<0.05),10μg/ml组OD值较对照组小,但差异无统计学意义(P>0.05)。作用72h时,0.1-0.001μg/ml组可促进人牙周膜细胞增殖(P<0.05),10μg/ml组与对照组相比抑制了牙周膜增殖(P<0.05)；5.淫羊藿苷对人牙周膜细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的影响：淫羊藿苷在矿化诱导条件下与人牙周膜细胞作用72h时,发现1-0.001μg/ml组可促进人牙周膜细胞碱性磷酸酶(ALP)活性(P<0.05),而10μg/ml组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；6.淫羊藿苷对人牙周膜细胞骨涎蛋白(BSP)表达水平的影响：淫羊藿苷与人牙周膜细胞在矿化诱导条件下作用72h后,0.1～0.001μg/ml组的BSP表达水平均较对照组显著增加(P<0.05)。1 u g/ml与10μg/ml组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。7.淫羊藿苷对人牙周膜细胞骨钙素(OCN)表达水平的影响：人牙周膜细胞在矿化诱导条件下与不同浓度淫羊藿苷作用72h后,1～0.01μg/ml组的OCN表达水平均较对照组显著增加(P<0.05),0.001μg/ml组的OCN表达水平较对照组高,但无统计学意义(P>0.05),10μg/ml组OCN表达水平较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1.胰酶消化玻片覆盖组织块法可成功原代培养人牙周膜细胞,培养周期短、成功率高,其来源可靠,细胞生长状态良好；2.人牙周膜细胞中具有可骨向分化的细胞群；3.一定浓度的淫羊藿苷可促进人牙周膜细胞增殖和骨向分化。

淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响

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