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目的：本研究旨在探索与人类DM相关的突变型(前)胰岛素原在胰岛β细胞功能凋亡中的作用。通过检测6个具有不同生物学特性的突变型(前)胰岛素原C(A7)Y、G(B8)S、V(A3)L、R(SP6)H、G(C28)R及DelCys,对大鼠INS-1细胞凋亡及增殖的影响,同时比较不同突变型胰岛素原对内质网应激(ERS)和非折叠蛋白反应(UPR)信号通路的影响,探讨了突变型(前)胰岛素原导致β细胞凋亡的分子机制,为进一步提高糖尿病的治疗效果提供理论和实验依据。方法：1.研究突变型(前)胰岛素原对大鼠INS-1细胞凋亡及增殖的影响用含小鼠野生型和6个含不同突变型小鼠前胰岛素原cDNA的重组质粒：m-WT及m-DelCys、m-C(A7)Y、m-G(B8)S、m-V(A3)L、m-R(SP6)H、m-G(C28)R,分别转染入INS-1细胞中,设m-WT组、m-DelCys组、m-C(A7)Y组、m-G(B8)S组、m-V(A3)L组m-R(SP6)H组m-G(C28)R组。设衣霉素组为阳性对照组,vector组为阴性对照组。转染48h后,应用流式细胞仪检测INS-1细胞的转染效率,应用细胞凋亡试剂盒(Annexin V-PE,7-AAD)检测INS-1细胞的凋亡情况,应用细胞增殖检测试剂盒(Cell Counting Kit-8)检测INS-1细胞的增殖情况。2.研究突变型(前)胰岛素原对ERS和UPR信号通路的影响实验分组同上,转染72h后,采用RT-PCR法检测细胞内ATF6mRNA和CHOPmRNA的表达水平,采用Western Blot检测细胞内ATF6蛋白的表达水平。结果：1.研究突变型(前)胰岛素原对大鼠INS-1细胞凋亡及增殖的影响。(1)应用流式细胞仪检测转染48h及72h后的转染效率,发现各转染组转染效率相似,差异无统计学意义(F=0.966,P=0.464)(F=0.548,P=0.795)。(2)转染48h后,检测细胞凋亡情况,发现：与衣霉素组相比,其它各组细胞凋亡率低于衣霉素组；与vector组相比,其它各组细胞凋亡率高于vector组；除衣霉素组及vector组外,m-DelCys组和m-C(A7)Y组的细胞凋亡率高于m-WT组、m-G(B8)S组、m-V(A3)L组、m-R(SP6)H组、m-G(C28)R组,差异有统计学意义(F=37.599,P=0.000)。(3)检测转染48h后细胞增殖情况,发现：与衣霉素组相比,vector组、m-WT组、m-G(B8)S组、m-V(A3)L组、m-R(SP6)H组、m-G(C28)R组的细胞增殖高于衣霉素组；与vector组相比,其它各组细胞增殖低于vector组,差异有统计学意义(F=8.047,P=0.000)。2.研究突变型(前)胰岛素原对ERS和UPR信号通路的影响(1)转染72h后,与衣霉素组比较,m-V(A3)L组,m-R(SP6)H组,m-G(C28)R组,m-WT组ATF6mRNA及蛋白表达水平低；与vector组比较,其它各组ATF6mRNA及蛋白表达水平高；与m-DelCys组,m-C(A7)Y组和m-G(B8)S组比较,m-V(A3)L组,m-R(SP6)H组,m-G(C28)R组,m-WT组ATF6mRNA及蛋白表达水平低；衣霉素组,m-DelCys组,m-C(A7)Y组,m-G(B8)S组组间比较和m-V(A3)L组,m-R(SP6)H组,m-G(C28)R组,m-WT组组间比较,ATF6mRNA及蛋白表达水平无统计学差异(F=7.197, P=0.000)(F=7.641, P=0.000)。(2)转染72h后,与衣霉素组比较,m-G(B8)S组,m-V(A3)L组,m-R(SP6)H组,m-G(C28)R组,m-WT组CHOPmRNA表达水平低；与vector组比较,其它各组CHOPmRNA表达水平高；与m-DelCys组和m-C(A7)Y组比较,m-G(B8)S组,m-V(A3)L组,m-R(SP6)H组,m-G(C28)R组,m-WT组CHOPmRNA表达水平低；衣霉素组,m-DelCys组,m-C(A7)Y组组间比较和m-G(B8)S组,m-V(A3)L组,m-R(SP6)H组,m-G(C28)R组,m-WT组组间比较,CHOPmRNA表达水平无统计学差异(F=7.741,P=0.000)。结论：1.采用阳离子脂质体法转染突变型小鼠前胰岛素原DelCys, C(A7)Y, G(B8)S, V(A3)L, R(SP6)H, G(C28)R,各转染组转染效率均高于40%,且各转染组转染效率相似。2.突变型小鼠前胰岛素原DelCys,C(A7)Y,G(B8)S,V(A3)L, R(SP6)H,G(C28)R,均可引起β细胞凋亡,减弱β细胞增殖。其中突变型(前)胰岛素原Delcys和C(A7)Y引起p细胞凋亡,减弱β细胞增殖的作用强于突变型(前)胰岛素原G(B8)S, V(A3)L, R(SP6)H, G(C28)R。这可能与Delcys和C(A7)Y突变造成胰岛素原错误折叠的严重程度相关,并可能存在G(B8)S, V(A3)L, R(SP6)H, G(C28)R突变引发其它减弱β细胞凋亡,增加β细胞增殖的机制。3.突变型(前)胰岛素原DelCys, C(A7)Y, G(B8)S, V(A3)L, R(SP6)H, G(C28)R,因影响胰岛素原的正确折叠,引发胰岛素原错误折叠,导致ERS,主要是通过ATF6信号通路激活UPR来完成的。在突变型(前)胰岛素原DelCys, C(A7)Y,G(B8)S引发ERS的过程中,ATF6信号通路发挥重要作用。4.突变型(前)胰岛素原DelCys, C(A7)Y, G(B8)S, V(A3)L, R(SP6)H, G(C28)R,通过CHOP介导途径引发INS-1细胞凋亡,在突变型(前)胰岛素原m-DelCys、 m-C(A7)Y引发ERS,导致细胞凋亡的机制中,CHOP介导途径占重要地位。
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