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长期高盐摄入诱导自发性高血压大鼠心肌自噬性空泡形成

作　者: 毕莹
导　师: 李玉明
学　校: 天津医科大学
专　业: 内科学
关键词: 高盐摄入高血压自噬左心室重塑氧化应激
分类号: R544.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：长期高盐负荷不仅能引起血压水平增高,还可以独立于血压水平直接引起靶器官的损伤。在前期工作中我们发现,经饮食摄入8.0%NaCl能够促进自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)左心室结构和功能异常的出现,并且左心室由代偿性肥厚演变至失代偿性肥厚的关键时间窗为高盐负荷后8-12周。在相关病理学分析中我们观察到12周SHR大鼠心肌组织存在大量的空泡样结构,并且高盐组空泡的数量和面积明显高于低盐组,提示心肌组织的这种空泡结构可能与长期高盐摄入有关。因此,本研究旨在阐明SHR大鼠心肌组织空泡样结构的形成机制,及其与高盐负荷所致左心室功能和结构重塑的关系。方法：7周龄SHR及京都Wistar大鼠(Wistar Kyoto rats, WKY),经适应性喂养1周后,随机分为低盐饮食组(0.5%NaCl)和高盐饮食组(8.0%NaCl)两个亚组。在饮食盐干预8周、12周、16周末行有创血流动力学检测。检测结束后,心脏经冷生理盐水灌流,摘取心脏,左心室取一小块组织(0.5x0.5xlcm3)经2.5%戊二醛固定后行透射电子显微镜超微结构形态学检测,其余组织保存于-80℃冰箱。组织包埋、切片后行苏木素伊红(hematoxylin feosin, HE)染色、油红O染色、阿尔新蓝-过碘酸／希夫(alcian blue/periodic acid-schiff, AB-PAS)染色、甲苯胺蓝染色以检测心肌空泡内物质成份,行麦胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)染色检测心肌细胞横截面积,Masson染色检测心肌纤维化程度。Western blot检测自噬相关蛋白和转录因子张力应答增强子结合蛋白(tonicity-responsive enhancer binding protein, TonEBP)的表达量。体外研究采用大鼠H9c2细胞系,在额外添加NaCl(最终作用浓度分别为25mM,50mM,100mM,150mM,分别相当于350mOsm/L,400mOsm/L,500mOsm/L,600mOsm/L的渗透压)的完全生长培养基中培养24h,加入Na+荧光探针CoroNa Green,用流式细胞仪检测细胞内荧光强度。有报道显示SD大鼠食用含有8.0%NaCl的高盐饮食2周后皮肤中Na+浓度升高40mM。基于前期研究和CoroNa Green的检测结果,我们在正常培养基中额外加入50mM NaCl,使渗透压达到400mOsm/L,以模拟长期高盐负荷诱导的细胞外高渗环境。50mM NaCl培养基干预H9c2心肌细胞一定时间后用实时定量PCR和Western blot检测自噬相关基因和蛋白表达水平。50mM NaCl培养基干预H9c2心肌细胞24小时后用AnnexinV检测细胞凋亡。用50mM NaCl,50mM CsCl,100mmM甘露醇(400mOsm/L)和不同浓度活性氧(reactive oxygen species, ROS)清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)(0.5mM,2.0mM)干预H9c2心肌细胞后用流式细胞仪检测ROS产生水平,并用实时定量PCR和Western blot检测自噬相关基因和蛋白表达水平。结果：1)饮食盐干预16周时SHR高盐组比低盐组体重明显下降。12周与16周时,SHR和WKY高盐饮食组心脏重量增加,心肌细胞肥大和胶原沉积比低盐组明显增多。一系列左心室有创血流动力学分析结果显示高盐饮食进行性损害SHR左心室收缩(systolic blood pressure, SBP与+dP/dtmax)和舒张(left ventricular end diastolic pressure, LVEDP与-dP/dtmin)功能。提示高盐喂养SHR12周后左心室转变为失代偿性肥厚。在低盐喂养的SHR和高盐喂养的WKY随着时间延长胶原沉积增加,LVEDP升高,但是并没有出现左心室收缩功能和舒张功能的显著恶化。2)透射电子显微镜分析和病理染色显示在高盐干预的SHR心肌组织空泡样结构是自体吞噬体相互融合的结果。心肌组织Western blot结果也显示高盐负荷12周后SHR自噬相关蛋白(Beclinl;autophagy related5-autophagy related12, Atg5-Atgl2; lysosome associatedmembrane protein type1, LAMP1; microtubule-associated protein1light chain3Ⅱ, LC3Ⅱ)表达水平显著上调,这一现象一直持续到16周。上述结果显示高盐摄入引起的SHR左心室功能恶化与自噬水平过度上调有关。同时,高盐干预的WKY心肌组织也存在自噬水平的上调,但程度低于高盐SHR组。3) Western blot结果分析显示WKY和SHR高盐组TonEBP的表达水平比低盐组明显增加。体外实验中,H9c2心肌细胞内Na+浓度随着细胞外Na+浓度的升高而升高。而且,细胞外NaCl在50mM时就能够诱发凋亡,促使ROS产生和使自噬相关基因与蛋白的表达水平上调。而以等量Cs+替代Na+后,ROS产生显著减少,提示诱导H9c2心肌细胞产生ROS主要依赖于Na+。当ROS清除剂NAC清除产生的ROS,使自噬水平下降,进一步证实ROS对于加速诱导自噬发挥了关键作用。在与100mM甘露醇培养基(与50mM NaCl产生相同的渗透压)干预对照中发现,100mM甘露醇培养基同样能诱导ROS与自噬的水平上调,但程度不同于50mMNaCl培养基,提示过多Na+所引发ROS产生增加和自噬水平上调不完全依赖于渗透压的改变。结论：本研究表明,长期高盐摄入加速诱导的高血压性左心室功能恶化与自噬水平过度上调有关,其具体机制可能由于心肌间质高渗诱导细胞内Na+浓度升高触发ROS依赖性的自噬上调。

长期高盐摄入诱导自发性高血压大鼠心肌自噬性空泡形成

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