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逆转录病毒中介的VEGF-C/VEGFR-3信号通路调节对高盐摄入诱导的高血压性左心室重塑的干预作用

作　者: 杨国红
导　师: 李玉明
学　校: 天津医科大学
专　业: 内科学
关键词: 高盐摄入高血压 MPS细胞淋巴管增生左心室重塑 VEGF-C/VEGFR-3
分类号: R544.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究目的：长期高盐饮食是引起血压升高和相关心血管疾病的重要环境因素之一。此外,高盐摄入不仅可以引起血压水平的显著升高,还可以通过独立于血压水平的途径引起心、脑、肾等靶器官的损害。近年来研究显示,继发于高盐摄入的皮肤间质高渗状态可通过上调单核吞噬细胞系统(mononuclear phagocyte system, MPS)的张力应答增强子结合蛋白(tonicity responsive enhancer binding protein, TonEBP),引起血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)的表达上调,后者通过血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growth factor receptor-3, VEGFR-3),引起皮肤淋巴管增生,对高盐摄入引起的血压升高产生缓冲作用；而特异性的清除MPS细胞可以诱导产生盐敏感性高血压。在我们的近期研究中也发现,慢性高盐摄入(8.0%NaC1)维持12周可以引起自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)心肌组织显著的淋巴管的增生,并伴有心肌间质明显的MPS细胞浸润,这些证据提示在高盐摄入后心脏也可能存在TonEBP/VEGF-C/VEGFR-3通路的上调,但其病理生理学意义,尤其是与高盐摄入引起的心室重塑的关系尚不明确。因此,本研究通过观察高盐诱导的SHR不同时间点心肌组织淋巴管增生及MPS细胞浸润程度的变化,确定其变化规律,利用逆转录病毒载体在基因水平双向调节VEGF-C/VEGFR-3通路的激活,探讨这一途径在高盐摄入诱导的高血压性左心室重塑中的作用。研究内容与方法：(1)7周龄雄性SHR经适应性喂养一周后,随机分为低盐饮食组(low salt, LS,即普通饮食,含0.5%NaC1)和高盐饮食组(high salt, HS,含8%NaCl),每组大鼠再根据高盐摄入的时间不同分为8周、12周、16周组。12周、16周组大鼠在处死前均进行血流动力学检测。各组大鼠在高盐摄入期结束处死摘取心脏,分别做石蜡包埋切片,进行病理学分析、组织匀浆提取RNA和蛋白进行相关基因和蛋白表达水平的检测。(2)利用pSecTag-△NAC/VEGF-C/Cys152Ser (pSecTag-VC)和pLPCX-VEGFR-3-Rg (pLPCX-VRg,中和VEGF-C的作用)两个质粒构建出pLPCX-△N AC/VEGF-C/Cys152Ser (pLPCX-VC,特异性激活VEGFR-3)及对照质粒pLPCX,经PCR、双酶切及测序鉴定后,将三种逆转录病毒质粒分别转染PT67细胞系,嘌呤霉素筛选出能稳定产生重组逆转录病毒的转染细胞株,制备高滴度的重组逆转录病毒,并验证重组逆转录病毒在RAW264.7细胞及大鼠体内的表达。(3)7周龄雄性SHR经适应性喂养1周后,随机分为LS组和HS组,以同周龄京都Wistar大鼠(Wistar Kyoto rats, WKY)作为阴性对照。HS组再分为：HS组、HS+pLPCX-VC逆转录病毒组(HS+VC)、HS+pLPCX-VRg逆转录病毒组(HS+VRg)和HS+pLPCX逆转录病毒组(HS+Ctr)4个亚组,在高盐干预8周末分别经尾静脉给予相应的逆转录病毒干预。所有大鼠均于饮食干预12周后进行心脏超声和有创血流动力学检测,随后处死大鼠摘取心脏进行相关基因和蛋白表达水平检测以及组织病理学分析。结果：(1)随着饮食干预时间的延长,HS组大鼠的收缩压(systolic blood pressure, SBP)逐渐增高,12周时达到高峰,随后明显减低；左心室质量指数(left ventricular mass index, LVMI)亦逐渐升高,且均显著高于同一时间点的LS组(P<0.05),提示左心室重塑的加重；而体重则随饮食干预时间延长而减轻(P<0.05)。血流动力学分析显示,12周时HS组左心室收缩与舒张功能与同一时间点LS组相比尚未显著减低,而16周时HS组收缩与舒张功能均已显著减低(P<0.05)。12周、16周HS组淋巴管内皮细胞标志物相关基因Prox-1、Lyve-1和podoplanin及TonEBP、VEGF-C均显著高于LS组(P<0.05)。Western blot分析结果显示VEGF-C及Prox-1的蛋白表达水平从12周开始都高于同一时间点LS组(P<0.05), TonEBP表达水平在12周时也显著升高(P<0.05)。组织病理学分析结果显示,饮食干预12周后,HS组心肌细胞横截面积、心肌间质及血管周的纤维化程度、CD68阳性细胞数、血管及淋巴管数均显著高于LS组(所有P<0.05),提示高盐干预12周心肌间质开始出现显著的MPS细胞浸润及淋巴管增生。(2)成功构建出pLPCX-VC质粒,经PCR及双酶切鉴定正确,测序结果与目的基因完全一致,并构建出pLPCX质粒作为对照；经过转染PT67细胞和嘌呤霉素的筛选,得到能稳定产毒的PT67细胞株；收集的逆转录病毒上清经纯化浓缩,滴度分别为pLPCX-VC逆转录病毒(pLPCX-VC retrovirus, RetroVC)1.2×108CFU/mL, pLPCX-VRg逆转录病毒(pLPCX-VRg retrovirus, RetroVRg)2.84×108CFU/mL和pLPCX逆转录病毒(pLPCX retrovirus, RetroCtr)3.07×108CFU/mL. Western blot结果显示RetroVC和RetroVRg在RAW264.7细胞及大鼠体内均能成功表达。(3)各HS组LVM和LVMI均显著高于LS组和WKY组(P<0.05),但各HS组之间比较无显著差异。各组血压随时间均逐渐增高,HS+VC组血压显著低于HS组和HS+Ctr组(189±2.61vs.197±2.16,P<0.05；189±2.61vs.198±3.00,P<0.05),而HS+VRg组血压则显著增高(P<0.05)。超声结果显示左心室肥大程度HS+VC组显著低于HS+VRg组,而左心室功能较HS+VRg组也有显著改善(P<0.05)。有创血流动力学结果显示左心室舒张末期压(left ventricular end diastolic pressure, LVEDP) HS+VC组显著低于HS+VRg组；与HS组和HS+Ctr组相比,HS+VC组-dP/dtmin(主动舒张功能)和-dP/dtmin(收缩功能)显著增高,而HS+VRg组显著降低(P<0.05)。HS+VC组淋巴管内皮细胞相关标志物基因表达水平均显著高于HS组和HS+Ctr组,HS+VRg组而则显著降低；TonEBP基因表达水平各HS组显著高于低LS组和WKY组(P<0.05),而各HS组之间未见显著性差异；VEGF-C基因表达水平各HS组亦显著高于LS组和WKY组(P<0.05),且HS+VC组显著高于其它HS组(P<0.05)。Western blot结果显示,Prox-1蛋白表达水平与其mRNA表达水平有相同的变化趋势。与HS组和HS+Ctr组相比,HS+VC组心肌细胞横截面积显著减小,心肌间质和血管周纤维化程度显著减轻,CD68阳性MPS细胞浸润程度显著减低,并伴有显著的淋巴管增生,而HS+VRg组则表现出与HS+VC组相反的变化趋势,提示HS+VC组左心室重塑程度减轻而HS+VRg则显著加重。结论：本研究显示,长期的高盐负荷引起SHR心肌间质明显的MPS细胞浸润及淋巴管的增生。逆转录病毒中介的VEGF-C表达上调可通过VEGFR-3信号通路促进淋巴管增生,同时显著减轻心肌间质MPS细胞浸润,并改善左心室收缩和舒张功能,减轻长期高盐负荷导致的高血压性左心室重塑,提示VEGF-C可能是高血压及高血压性左心室重塑的一个潜在治疗靶点。

逆转录病毒中介的VEGF-C/VEGFR-3信号通路调节对高盐摄入诱导的高血压性左心室重塑的干预作用

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