学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

RTA2基因降低白念珠菌对氟康唑敏感性的机制研究

作　者: 贾宇
导　师: 姜远英
学　校: 第二军医大学
专　业: 药理学
关键词: 白念珠菌钙调神经磷酸酶 Rta2p 氟康唑
分类号: R519.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 32次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

在白念珠菌（Candida albicans）中，由于越来越多的菌株对药物产生了耐药性，导致临床上用于治疗念珠菌感染的一线药物氟康唑（Fluconazloe,FLC）的治疗产生失败。我们实验室前期的研究发现：在体外，RTA2基因编码的蛋白参与了由白念珠菌钙调神经磷酸酶（calcineurin,CaN）信号通路介导的对氟康唑的耐药。在本研究中，通过药物敏感性实验考察不同基因背景的RTA2基因相关菌株对氟康唑的敏感性差异，发现：在野生型菌株（cnaΔ/Δ::CNA，crz1Δ/Δ::CRZ1，rta2Δ/Δ::RTA2）中加入1mM CaCl2可以激活CaN信号通路，使菌株对唑类药物氟康唑的敏感性显著降低（最低抑菌浓度由0.5μg/ml升高为16μg/ml和64μg/ml）；加入1mM CaCl2激活CaN信号通路，RTA2基因缺失菌（rta2Δ/Δ,cnaΔ/Δ::CNA；rta2Δ/Δ, crz1Δ/Δ::CRZ1）和钙调神经磷酸酶CNA基因缺失菌（cnaΔ/Δ,rta2Δ/Δ::RTA2）以及CaN信号通路转录因子CRZ1基因缺失菌（crz1Δ/Δ, rta2Δ/Δ::RTA2）一样，对氟康唑的敏感性无显著变化。说明在体外钙离子激活的CaN信号通路通过RTA2p降低白念珠菌对氟康唑的敏感性。通过透射电镜实验考察不同浓度的氟康唑对不同基因背景的RTA2基因相关菌株细胞膜超微结构的影响，我们发现：在体外，钙离子激活钙调神经磷酸酶通路后，可以通过Rta2p来减弱氟康唑对细胞膜的损伤，从而显著的降低了白念珠菌对氟康唑的敏感性。此外，我们构建了小鼠深部真菌感染模型，考察基因RTA2对模型动物生存时间及肾脏荷菌量的影响，发现：RTA2基因本身并不能影响白念珠菌的毒力；但RTA2基因缺失后，感染小鼠接受氟康唑治疗后，生存率显著提高；相反，异位表达RTA2基因显著的降低了氟康唑在宿主中对白念珠菌的疗效。综上所述，我们认为在体内体外钙离子激活的钙调神经磷酸酶通路，通过Rta2p来降低白念珠菌对氟康唑的敏感性。在白念珠菌中，基因RTA2是钙调神经磷酸酶通路调控的一个下游基因，但是其调控机制并不明确。本课题采用海肾荧光素酶报告基因（Renilla Luciferase，RLUC）系统进行研究：将不同长度的RTA2基因启动子片段连接到报告基因载体中，再将构建好的载体分别转入菌株DJY201（Δ/Δcna,Δ/Δrta2）、MJY201（Δ/Δcrz1,Δ/Δrta2）、JXM101（Δ/Δrta2）中，考察加入钙离子前后荧光活性的变化倍数。进一步证明RTA2基因是CaN信号通路的靶基因，其表达水平受到转录因子Crzlp的调控；发现Crzlp的DNA结合序列—钙调神经磷酸酶依赖性应答元件（calcineruin-dependent responseelement,CDRE），可能位于RTA2基因启动子上游-973bp~-920bp的区间内，通过生物信息学分析推测其序列可能为GATGT。我们实验室前期研究发现：在临床白念珠菌中，外源性加入1mMCaCl2激活CaN信号通路，可以不同程度的上调RTA2基因的表达水平。通过小鼠深部真菌感染模型发现，钙离子诱导的RTA2基因高表达的菌株感染的小鼠接受氟康唑治疗后，生存率显著低于钙离子诱导的RTA2基因非高表达的菌株感染的小鼠。本研究通过体外药物敏感性实验和实时定量（Real-Time） PCR实验发现：钙离子诱导的菌株对氟康唑敏感性降低和RTA2基因的表达水平密切相关。在钙离子诱导的RTA2基因高表达的临床菌株0511522中，敲除了RTA2基因。通过体外药物敏感性实验发现， RTA2基因缺失菌RTA2N4（△/△rta2）无法产生钙离子介导的对氟康唑的敏感性降低；通过小鼠深部真菌感染模型发现，敲除RTA2基因并不影响菌株的毒力；但是RTA2基因缺失后，感染动物接受氟康唑治疗以后，生存率显著升高。综上所述，在体内体外钙离子通过激活钙调磷酸酶通路诱导RTA2基因高表达从而降低临床菌株对氟康唑的敏感性。

RTA2基因降低白念珠菌对氟康唑敏感性的机制研究

内容摘要

全文目录

相似论文