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实时荧光定量PCR技术在深部念珠菌感染早期诊断中的研究

作　者: 郭强
导　师: 顾军；王英；吴建华
学　校: 第二军医大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 深部念珠菌感染深部真菌感染荧光定量PCR 白念珠菌光滑念珠菌近平滑念珠菌克柔念珠菌热带念珠菌检测鉴别
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

实时荧光定量PCR技术在深部念珠菌感染早期诊断中的研究近年来随着广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛应用,深部真菌感染的发病率和死亡率也呈逐年递增的趋势。大量临床资料和经验表明,深部真菌感染的疗效与转归,很大程度上取决于早期诊断和治疗。目前研究显示住院患者中60%的深部真菌感染是由白念珠菌引起,且其在人体中是致病状态还是定植状态,与它的繁殖数量有关。同时发现非白念珠菌的检出率已逐步增加,且耐药性较高。因此,不仅要早期、快速诊断深部真菌病,还要在短时间内尽快鉴别致病菌,以选择敏感有效的药物进行有效治疗。然而,临床上深部真菌感染的诊断面临着巨大的困难和挑战,目前仍在沿用传统方法,这些方法有耗时长、易污染、难定量等缺点,很大程度上制约了早期诊断和治疗,延误了最佳治疗时机。鉴于目前存在的问题,本课题拟在其他研究基础上,利用实时荧光定量PCR技术中的荧光嵌合法为基本原理,设计白念珠菌特异性引物,利用白念珠菌标准菌株构建重组质粒建立标准品,不断优化荧光定量PCR实验反应条件,绘制成白念珠菌的循环阈值(Ct)与拷贝数log(Copy number)之间的标准曲线图,其他待测样品则根据其作为标准进行检测定量,从而得以快速检测并明确诊断。同时,为了进一步快速鉴别五种常见念珠菌以选择敏感有效的药物进行治疗。我们尝试利用真菌通用引物,构建五种不同念珠菌的重组质粒作为标准品,对其进行实时荧光定量PCR检测并分别得到五种念珠菌特异性的融解温度。融解温度与PCR扩增产物的序列有关,对于某一PCR扩增产物,其值是固定的。根据不同的融解温度,使我们可快速鉴别不同的致病菌种。第一部分实时荧光定量PCR技术检测白念珠菌方法的研究目的探索利用实时荧光定量PCR技术检测白念珠菌的快速、可靠的新方法。方法在NCBI的Genbank中查找不同菌种的18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA以及ITSⅠ、ITSⅡ基因序列,通过BLAST比对找出白念珠菌特异的基因序列,并保证此段高度保守。根据引物设计的原则,利用Primer 5.0设计白念珠菌特异性引物,扩增目的基因片段大约为270bp。应用特异性引物对白念珠菌标准菌株进行常规PCR,产物经1%琼脂糖凝胶电泳,大约为270bp,紫光灯下切胶,试剂盒胶回收。将回收的片段与载体pMD18-T vector连接,构建白念珠菌重组质粒;将质粒转化到DH5感受态细胞,在含氨苄抗性的LB固体培养基上过夜筛选单克隆,提取重组克隆质粒,10μl白念珠菌重组质粒送至上海美孚公司进行测序鉴定,其余白念珠菌重组质粒-20℃保存备用为荧光定量PCR标准品。将鉴定好的白念珠菌重组质粒纯化后,于紫外分光光度计上进行定量,根据重组质粒的碱基长度计算其分子质量,根据分子质量计算浓度,进而计算每微升所含的拷贝数,10倍稀释成5×107–5×103浓度梯度。在最佳反应条件下,每个浓度平行加入3个反应管同时进行扩增,反应结束后计算机自动绘制标准曲线。结果白念珠菌重组质粒测定稀释后,在最佳反应条件下进行定量扩增,得出了一条标准曲线及扩增曲线图。从而可以得出循环阈值(Ct)与拷贝数log(Copy number)之间的线性关系表达式:y=–3.385x+42.80。荧光定量PCR技术检测白念珠菌最低能检测到10个拷贝的基因,即相当于(1-5)CFU/ml,同时与其他真菌、细菌及病毒等无交叉阳性反应。结论实时荧光定量PCR技术检测白念珠菌不仅具有较高的敏感性和特异性,而且可以对白念珠菌进行定量。第二部分实时荧光定量PCR技术快速鉴别五种念珠菌方法的研究目的探索利用实时荧光定量PCR技术快速鉴别五种常见念珠菌的方法。方法应用真菌通用引物ITS4和ITS86分别与白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌进行常规PCR,产物经1%琼脂糖凝胶电泳,扩增目的基因片段分别约为300bp、360bp、260bp、248bp、214bp。紫光灯下切胶,试剂盒胶回收。分别将胶回收的片段与载体pMD18-T vector连接,构建五种不同念珠菌重组质粒;分别将五种不同念珠菌的质粒转化到DH5感受态细胞,含氨苄抗性的LB固体培养基上过夜筛选单克隆,提取重组克隆质粒,分别将10μl五种不同念珠菌重组质粒送至上海美孚公司进行测序鉴定,其余五种念珠菌重组质粒-20℃保存备用为荧光定量PCR标准品。将鉴定测序的五种念珠菌重组质粒纯化后,于紫外分光光度计上进行定量,根据重组质粒的碱基长度计算其分子质量,根据分子质量计算浓度,进而计算每微升所含的拷贝数,分别10倍稀释成1010–104浓度梯度。在最佳反应条件下,五种不同念珠菌按1010–104浓度梯度同时进行扩增,连续进行8组相同反应,结束后计算机自动生成特异性的融解温度和绘制融解曲线图。结果五种不同的念珠菌重组质粒测定稀释后,在最佳反应条件下进行荧光定量反应,自动生成融解温度和融解曲线图。该反应生成的融解温度与PCR扩增产物的序列有关,对于某一PCR扩增产物,其值是固定的。通过分析融解温度和融解曲线,可以确定PCR反应的特异性。五种不同的念珠菌有各自固定的融解温度,根据该融解温度的不同,可快速鉴别五种不同的念珠菌。结论利用实时荧光定量PCR技术可鉴别五种常见念珠菌,具有快速、简单、可靠的特点,且不易受外界环境的影响。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
英文缩写  12-13
前言  13-17
  参考文献  15-17
第一部分实时荧光定量PCR 技术检测白念珠菌方法的研究  17-34
  一、主要实验试剂和仪器设备  17-19
  二、实验方法  19-25
  三、实验结果  25-31
  四、讨论  31-32
  参考文献  32-34
第二部分实时荧光定量PCR 技术快速鉴别五种念珠菌方法的研究  34-54
  一、试剂和仪器  34-36
  二、实验方法  36-38
  三、实验结果  38-51
  四、讨论  51-52
  参考文献  52-54
结论  54-55
文献综述  55-60
  参考文献  58-60
研究生就读期间发表论文及参加学术活动情况  60-61
致谢  61

实时荧光定量PCR技术在深部念珠菌感染早期诊断中的研究

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