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通用真菌引物和探针检测人全血标本中侵袭性真菌DNA载量的方法

作　者: 徐云飞
导　师: 马恩陵
学　校: 北京协和医学院
专　业: 外科学
关键词: 肠外营养实时定量PCR 通用真菌引物和探针肠粘膜屏障外科感染人全血
分类号: R446.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

长期肠外营养支持的外科危重患者可出现肠黏膜屏障损伤及肠道微生物移位入血引起全身感染及发热,不恰当的抗生素应用不但无疗效且会进一步损伤肠粘膜屏障；因此有必要建立快速鉴别血中细菌及真菌等各类微生物的方法。本研究旨在建立实时定量PCR (RQ-PCR)以真菌通用引物和探针快速准确检测人全血标本中侵袭性真菌DNA载量的方法并与细菌相鉴别及进行初步临床应用。在论文中,选择临床常见基因组多拷贝基因5.8S rDNA作为靶基因设计特异性引物和TaqMan探针,采用QIAamp(?) DNA Blood Mini Kit提取多种致病真菌基因组DNA,建立20μl RQ-PCR反应体系,对含有不同载量致病真菌的模拟人全血标本和71份外科发热患者全血标本进行侵袭性真菌基因组的定量检测。结果显示本方法的特异性良好,检测限为1.0×101copies/μl上机待测的扩增反应液(即约1.0×105copies/ml全血)；检测灵敏度和特异度分别为95.5%和97.6%,阳性预告值和阴性预告值分别为98.7%和92.0%；标准曲线R2在0.9931-0.9977之间；批内及批间平均重复性变异系数(CV)分别为(10.4±4.0)%和(27.9±2.0)%；人血标本中真菌基因组DNA平均回收率为(91.0±7.6%),相对回收率平均变异系数为(14.9±4.0)%。71份外科发热患者血标本中未检测出侵袭性真菌基因组。RQ-PCR可以借通用真菌引物和TaqMan探针快速、特异、灵敏地定量检测人血标本中侵袭性真菌DNA的载量并可与细菌相鉴别,且有着较好的准确度与精密度。外科发热患者血中侵袭性真菌基因组的存在率可能很低。

全文目录

中文摘要  5-6
Abstract  6-7
中英文名词对照  7-9
前言  9-13
一、实验材料  13-17
  (一) 主要仪器  13-14
  (二) 试剂及耗材  14-15
  (三) 菌种来源  15-16
  (四) 标本采集  16-17
二、实验方法  17-41
  (一) 通用真菌特异性引物及TaqMan探针设计  17
  (二) 培养基的制备  17-18
  (三) 单孢子悬液的制备  18-20
  (四) 基因组DNA提取  20-22
  (五) 引物有效性及特异性验证  22-23
  (六) 探针有效性及特异性验证  23-24
  (七) 标准品的制备  24-30
  (八) 实时定量PCR引物和探针浓度优化  30-34
  (九) 实时定量PCR反应体系建立及实验流程  34-38
  (十) 检测限及特异度、灵敏度、阳性预告值与阴性预告值测定  38
  (十一) 线性标准曲线的建立  38
  (十二) 仪器准确度及重复性测定  38-39
  (十三) 人全血标本中侵袭性真菌基因的相对回收率测定  39
  (十四) 模拟血标本存放稳定性监测  39
  (十五) RQ-PCR对临床血标本中侵袭性真菌的检测  39-40
  (十六) 统计学处理  40-41
三、实验结果  41-55
  (一) 通用引物及TaqMan探针序列  41
  (二) 引物和探针特异性验证  41-42
  (三) 菌落PCR  42-43
  (四) 测序  43
  (五) 比对  43-44
  (六) 质粒电泳  44-45
  (七) 质粒PCR  45-46
  (八) 标准品质粒的浓度测算  46
  (九) 实时定量PCR引物和探针的浓度优化  46-49
  (十) 检测限及特异度、灵敏度、阳性预告值与阴性预告值测定  49-51
  (十一) 标准曲线线性范围  51-52
  (十二) 仪器的重复性  52-53
  (十三) 血标本中致病真菌基因组回收率测定  53
  (十四) 模拟血标本存放的稳定性  53-54
  (十五) 临床标本检测结果  54-55
四、讨论  55-60
文献综述  60-73
参考文献  73-81
致谢  81-82
个人简历  82-83

通用真菌引物和探针检测人全血标本中侵袭性真菌DNA载量的方法

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