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单通道双酶同步测定及其免疫分析应用

作　者: 刘红博
导　师: 廖飞
学　校: 重庆医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 单通道双酶同步分析酶联免疫吸附分析显色底物显色产物等吸收波长
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

多酶同步分析可显著提高检测效率。已有的用两种酶标记的单通道测量两组分的ELISA技术，并没有实现单通道两种酶同步反应和同步检测。本实验室建立了基于等吸收波长原理的单通道双酶同步分析方法（简称SDESA），并将其成功应用于ELISA（简称SDESA-ELISA），该方法在同一体系中，同时启动并同步监测所有标记酶的反应。SDESA的技术关键在于选择一对合适的显色底物和一对合适的标记酶，并建立消除吸收重叠干扰和混合体系中物质干扰的数据处理方法，从而使SDESA-ELISA的检测限、灵敏度及线性范围与单组份ELISA相当。为解决上述问题，本实验室对SDESA进行了下列研究：1.复杂动力学体系双酶同步测定-建立消除干扰的数据处理方法用于单通道双酶同步测定的两种酶需满足以下要求：（a）酶A作用于底物A生成产物A，酶B作用于底物B生成产物B。产物A的最大差吸收峰（λA）远远大于产物B的最大差吸收峰（λB），且λB在产物A和底物A的最大等吸收波长（λ0）附近。（b）λA和λ0处的光吸收值通过快速变换检测波长进行定量，基于吸收的线性加和性消除吸收重叠干扰。（c）通过反应曲线动力学分析消除体系中物质对待测酶的干扰（抑制或激活）。（d）如果底物A的浓度低于其米氏常数，则选用本实验室建立的联用策略对酶A进行定量。分析γ-谷氨酰基转移酶（GGT）和乳酸脱氢酶（LDH）同步测定的复杂动力学过程，并以此作为SDESA的化学计量学模型。GGT作用于γ-谷氨酰基-对硝基苯胺（GGPNA），释放出对硝基苯胺（PNA），PNA最大差吸收峰λA在405nm附近，GGPNA和PNA的最大等吸收波长λ0在344nm；LDH消耗还原态尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，还原型辅酶Ⅰ），NADH的最大差吸收峰λB在340nm。通过对反应过程的动力学分析，消除了PNA对LDH的抑制作用；通过联用策略测定的GGT初速度线性范围以及消除干扰后的LDH线性范围都与各自单独测定时的线性范围相当；当一种酶的活力相当于另一种酶的25倍时，活力较低的酶通过SDESA的定量限仍然与单独测定时相当。2.简单动力学体系的双酶同步测定及在免疫分析中的应用（一）为了探索SDESA的潜在应用价值，牛小肠碱性磷酸酶（ALP）和β-D-半乳糖苷酶（BGAL）被用作酶联免疫吸附分析（ELISA）的标记酶，用于小分子半抗原的单通道同步测定。ALP作用于4-硝基-1-萘酚磷酸酯（4NNPP），释放出4-硝基-1-萘酚（4NNP），4NNP最大差吸收峰λA在458nm，4NNPP和4NNP的最大等吸收波长λ0在405nm；BGAL作用于对硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（PNPG），释放出4-硝基苯酚（4NP），4NP的最大差吸收峰λB在405nm。由于不存在底物或产物间的干扰，ALP和BGAL的组合可用于ELISA同步分析单通道内的青霉素G和克伦特罗。结果表明，任意一个半抗原同步测定时的定量限均与单独测定时基本相当，因此，SDESA具有广阔的应用前景；获得一对恰当的显色底物和一对适当的标记酶是其应用于ELISA的关键。3.简单动力学体系的双酶同步测定及在免疫分析中的应用（二）通常情况下，糖苷酶之间都具有良好的缓冲液兼容性，且几乎不存在底物或产物的相互干扰。BGAL水解4-硝基-1-萘酚-β-D-半乳糖苷（4NNPG），释放出4-硝基-1-萘酚（4NNP），4NNP最大差吸收峰λA在458nm左右，4NNPG和4NNP的最大等吸收波长λ0在400nm；α-D-葡萄糖苷酶（AGLU）作用于对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷（4NPG），释放出4-硝基苯酚（4NP），4NP的最大差吸收峰λB在400nm。这种特性使得BGAL和AGLU可作为同步分析ELISA的标记酶，通过快速变换检测波长，同时测定405nm和450nm的吸收。事实上，用青霉素G标记的BGAL和克伦特罗标记的AGLU作为示踪剂的竞争性ELISA，单通道内青霉素G和克伦特罗同步测定的结果都与单独测定的结果具有良好的一致性，对于任意一种半抗原，同步测定的精密度和回收率均与单独测定时相当。因此，对一个作用于底物产生4-硝基-1-萘酚的糖苷酶和另一个作用于底物产生4-硝基苯酚的糖苷酶进行分子工程改造以得到比活力足够高的酶作为一组标记酶，可使得同步分析ELISA成为一种可行的、新型的免疫分析平台，该平台不仅提高了分析效率，而且可获得令人满意的灵敏度。4.标记酶筛选我们通过以上两组SDESA-ELISA应用实例得出以下结论，为获得良好的检测效果，SDESA-ELISA的一对显色底物和一对标记酶的选择需遵循以下几点原则：（a）一个显色底物的最大等吸收波长应该等于或接近405nm，其产物最大吸收峰在450nm或490nm附近，而另一个显色底物的产物最大吸收峰应在405nm附近，从而保证在最优条件下用传统光度计进行同步检测时，任意一个显色产物的定量灵敏度和LOQ都与各自单独测定时相当。（b）一对合适的标记酶应该在相同的缓冲液中对一对预先选定的显色底物具有足够高的比活力，且耐受来自SDESA体系中物质的干扰，从而简化数据处理过程。一般来说，一对标记酶的最适缓冲液最好兼容。在Tris-HCl和PBS中，ACHE作用于硫代乙酰胆碱均表现出较高的比活力，因此，ACHE即可与在碱性Tris-HCl缓冲液中表现出高比活的碱性磷酸酶组合又可与以生理pH的磷酸盐为最适缓冲液的糖苷酶组合用于SDESA。SDESA结果表明，ECAP和ACHE或BGAL和ACHE的同步测定中都几乎不存在体系中物质对酶活力的干扰，表明了SDESA的可行性。

全文目录

符号说明  5-6
摘要  6-10
ABSTRACT  10-15
前言  15-23
  参考文献  19-23
第一部分复杂动力学体系的双酶同步测定-建立消除干扰的数据处理方法  23-38
  材料与方法  23-27
  结果  27-33
  讨论  33-36
  参考文献  36-38
第二部分简单动力学体系的双酶同步测定用于免疫分析的标记酶组合方案（一）  38-54
  材料与方法  38-43
  结果  43-51
  讨论  51-53
  参考文献  53-54
第三部分简单动力学体系的双酶同步测定用于免疫分析的标记酶组合方案（二）  54-65
  材料与方法  54-56
  结果  56-62
  讨论  62-64
  参考文献  64-65
第四部分标记酶组合的继续筛选  65-70
  材料与方法  65-67
  结果  67
  讨论  67-69
  参考文献  69-70
全文总结  70-71
致谢  71-72
攻读硕士学位期间发表的论文  72-73

单通道双酶同步测定及其免疫分析应用

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