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8-氧乙酰山栀酸甲酯抗脑缺血及促血管新生研究

作　者: 蒋王林
导　师: 陈西广
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 8-氧乙酰山栀酸甲酯脑缺血神经保护血管新生
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

中风与癌症、心血管疾病被认为是主要导致人死亡的原因之一,严重危害人们的健康。脑中风是一种严重的神经性疾病,是一个复杂多变的病理生理过程,其发病机理目前尚未完全阐明,目前提出的病理机制有兴奋性氨基酸中毒、炎症反应、氧化损伤、代谢性酸中毒、细胞内钙超载、线粒体损伤,细胞凋亡、免疫炎症损伤、离子失衡、减少缺血半暗带的神经细胞死亡、神经保护等学说。根据这些学说和机制而采取的治疗措施以及研制的治疗药物,到目前为止尚未获得满意的疗效。1995,美国FDA批准的抗脑卒中治疗药物NINDS rt-PA在卒中发生后3h内使用可明显改善中风3个月时的功能恢复,但卒中发生后3h内使用是其最大的缺陷。随后发展的治疗药物尿激酶原(溶栓药)在6h内动脉给予可明显改善中风的功能恢复,而中风发作超过3-6h若使用上述溶栓药后可导致脑内出血和脑水肿,而通常患者在发生脑卒中后的3-6h内并不能及时到达医院接受上述治疗,所以患者能接受溶栓治疗的几率相对较低,不到5%。上述溶栓药只在中风发作6h之内使用,大大限制了其应用。因此,寻找一个安全有效的既能用于脑卒中早期治疗,又能用于后期功能恢复的药物很有必要。迄今为止尚无符合上述条件的理想治疗药物。8-氧乙酰山栀酸甲酯(ND01)是山东省天然药物工程技术研究中心研究人员从中药独一味Lamiophlomisrotata(Benth.)Kudo茎叶中提取分离出来的一种环烯醚萜化合物。前期对8-氧乙酰山栀酸甲酯在脑血管疾病方向进行了药理学筛选,结果显示具有较好的药理活性,拟开发为治疗缺血性脑中风的药物。本文研究了ND01对缺血性脑损伤的保护作用及脑缺血后的促血管新生作用,并探讨了对缺血性脑损伤以及脑缺血后促血管新生的可能的作用机制。一、ND01对缺糖和缺氧损伤的新生鼠皮层神经元的保护作用以培养的新生鼠皮层神经元制备缺糖和缺氧损伤模型,观察给予一定浓度的ND01对神经元存活、线粒体抗氧化酶、线粒体呼吸酶和呼吸功能、细胞LDH漏出、、细胞内[Ca2+]i及凋亡的影响,结果表明给予浓度为3-81μM的ND01对新生鼠皮层神经元缺糖-缺氧损伤有明显的保护作用,能明显降低神经元凋亡及坏死神经元的百分率,减少LDH的漏出,抑制细胞[Ca2+]i水平的升高,改善线粒体能量代谢。二、ND01对全脑缺血大鼠脑损伤的保护作用结扎大鼠双侧颈总动脉90分钟,再通22.5h,制备大鼠的全脑缺血再灌损伤模型,观察静脉注射给予ND01对全脑缺血大鼠脑损伤的神经保护作用,结果表明NDO110mg/kg、20mg/kg静脉给药显著降低全脑缺血大鼠神经细胞的坏死和凋亡且具有明显的剂量依赖关系。三、ND01对大鼠局部脑缺血损伤的保护作用线栓法制作大鼠中动脉栓塞模型,观察静脉注射给予ND0l对大鼠中动脉栓塞导致的局部脑缺血大鼠脑损伤的神经保护作用,结果表明NDO110mg/kg、20mg/kg静脉注射给药明显减小局灶性脑缺血大鼠缺血24h和7天时的脑梗死面积,减轻神经运动功能障碍,明显减轻脑水肿程度。四、NDO1对大鼠脑缺血再灌损伤的剂量-效应、治疗时间窗及长期作用研究线栓法制作大鼠中动脉栓塞模型,脑缺血1.5h后再灌注,观察静脉注射ND01对大鼠脑缺血再灌损伤的剂量-效应、治疗时间窗及长期作用。量效关系结果分析显示,ND01单次静脉注射超过10mg/kg能够显著改善缺血导致的神经行为缺陷,增加缺血区的脑神经元存活数量；单次静脉注射40mg/kg以上改善缺血导致的神经行为缺陷更显著,缺血区的存活神经元数量明显多于10mg/kg和20mg/kg,提示随着ND01剂量的增加药效明显增强。治疗时间窗分析显示,再灌30min、1h、3h、5h后单次静脉注射20mg/kg能够显著改善缺血导致的神经行为缺陷,增加缺血区的脑神经元存活数量；但再灌7h单次静脉注射20mg/kg不能改善缺血导致的神经行为缺陷,缺血区的脑神经元存活数量亦未明显多于模型组,提示随着时间延长,给予ND01药效明显减弱。长期治疗作用分析显示,再灌30mmin单次静脉注射20mg/kg能够显著改善造模第3天、第7天和第14天缺血导致的神经行为缺陷,增加缺血第14天时缺血区的脑神经元存活数量,提示静脉给予一定剂量的ND01具有明显的长期神经保护作用。五、ND01对人脐静脉内皮细胞体外增殖、迁移及血管生成的作用以人脐静脉内皮细胞为研究对象,SRB法测定细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移能力以及胶原基质胶三维培养的内皮细胞检测体外血管生成能力,结果给予浓度为9-81μM的ND01明显增加人脐静脉内皮细胞细胞增殖能力和迁移能力,另外血管样结构生成能力亦明显增强。六、ND01对局部脑缺血再灌大鼠血管新生的作用栓线法制作大鼠中动脉栓塞再灌损伤模型,缺血24h后静脉给予ND01,观察ND01对缺血再灌大鼠促血管新生的作用,结果NDO15mg/k、10mg/kg静脉给药7天和14天明显改善缺血再灌大鼠的神经行为缺陷,促进缺血再灌大鼠缺血区的血管新生,增加再灌大鼠缺血区VEGF、Ang1和Tie2蛋白表达,同时增加缺血再灌大鼠缺血区磷酸化Akt和磷酸化Tie2表达,而且未增加缺血再灌大鼠血脑屏障通透性,提示ND01促脑缺血大鼠血管新生可能通过PI3K/Akt信号通路。结论：ND01对体外缺糖-缺氧损伤神经元具有明显的保护作用；对动物缺血性脑损伤具有明确的保护作用且具有明显的剂量-效应关系、治疗时间窗及长期作用,体内和体外研究结果显示均促进血管新生。抑制Ca2+超载和凋亡、改善线粒体能量代谢是ND01发挥其抗急性脑缺血的可能机制,通过PI3K/Akt信号通路是8-氧乙酰山栀酸甲酯促血管新生的可能机制。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-12
目录  12-18
前言  18-25
  1 缺血性中风及其治疗药物研究现状  18
  2 缺血性脑血管疾病与血管新生  18-19
  3 Ang1/Tie2和PI3K/Akt信号通路  19-20
  4 本论文研究目标  20-22
  5 参考文献  22-25
1 8-氧乙酰山栀酸甲酯对缺糖-缺氧损伤新生鼠皮层神经元的保护作用  25-40
  引言  25
  1.1 实验材料  25-26
  1.2 方法  26-28
    1.2.1 新生鼠皮层神经元原代培养  26
    1.2.2 皮层神经元缺氧/复氧损伤模型的制备和实验分组  26-27
    1.2.3 ND01对细胞活力、LDH漏出和凋亡的影响  27
    1.2.4 测定细胞[Ca2+]i和caspase-3活性  27
    1.2.5 新生鼠皮层线粒体的分离和实验设计  27-28
    1.2.6 线粒体呼吸功能的测定  28
    1.2.7 线粒体呼吸酶活性测定  28
    1.2.8 数据统计  28
  1.3 结果  28-33
    1.3.1 ND01降低新生鼠皮层神经元缺糖-缺氧损伤导致的细胞毒性  28-29
    1.3.2 ND01抑制新生鼠皮层神经元缺糖-缺氧损诱导的凋亡  29
    1.3.3 ND01降低细胞内钙和caspase-3活性  29-32
    1.3.4 ND01改善线粒体能量代谢,提高线粒体呼吸酶活性  32-33
  1.4 实验结论  33-36
  1.5 讨论  36-38
  1.6 参考文献  38-40
2 8-乙酰山栀酸甲酯对实验性脑缺血损伤的保护作用  40-61
  引言  40
  2.1 8-氧乙酰山栀酸甲酯对全脑缺血大鼠脑神经细胞损伤的保护作用  40-45
    2.1.1 实验材料  40-41
    2.1.2 方法  41-42
    2.1.3 结果  42-44
    2.1.4 结论  44-45
  2.2 8-氧乙酰山栀酸甲酯对大鼠脑缺血再灌损伤的剂量-效应、治疗时间窗及长期作用研究  45-50
    2.2.1 实验材料  45
    2.2.2 方法  45-47
    2.2.3 结果  47-49
    2.2.4 实验结论  49-50
  2.3 8-氧乙酰山栀酸甲酯对大鼠局部脑缺血损伤的保护作用  50-53
    2.3.1 实验材料  50
    2.3.2 方法  50-51
    2.3.3 结果  51-53
    2.3.4 实验结论  53
  2.4 讨论  53-56
  附图  56-60
  2.5 参考文献  60-61
3 8-氧乙酰山栀酸甲酯对血管新生的体外体内研究  61-85
  引言  61
  3.1 ND01对人脐静脉内皮细胞体外增殖、迁移及血管生成能力的影响  61-68
    3.1.1 材料  61-62
    3.1.2 方法  62-63
    3.1.3 结果  63-67
    3.1.4 结论  67-68
  3.2 8-氧乙酰山栀酸甲酯对脑缺血再灌损伤大鼠血管新生的影响  68-79
    3.2.1 材料  68
    3.2.2 实验方法  68-71
    3.2.3 结果  71-78
    3.2.4 实验结论  78-79
  3.3 讨论  79-81
  3.4 参考文献  81-85
4 中风及中风后血管新生研究进展  85-115
  4.1 中风病理机制、诱因及治疗药物研究进展  85-98
    4.1.1 缺血性中风  85-90
      4.1.1.1 缺血在细胞水平的反映  85-88
        4.1.1.1.1 线粒体功能丧失使细胞能量储存耗竭  85
        4.1.1.1.2 细胞膜的离子泵功能丧失  85
        4.1.1.1.3 释放兴奋性神经递质  85-87
        4.1.1.1.4 产生氧自由基和其他过氧化物  87
        4.1.1.1.5 凋亡  87
        4.1.1.1.6 神经保护  87-88
      4.1.1.2 缺血半暗带  88-89
      4.1.1.3 脑水肿  89
      4.1.1.4 缺血对脑结构完整性的影响  89-90
    4.1.2 出血性脑中风  90
    4.1.3 动脉粥样硬化和脑中风的关系  90
    4.1.4 症和脑中风的关系  90-95
      4.1.4.1 炎症状况与中风的关系  90-91
      4.1.4.2 感染状况与中风的关系  91
      4.1.4.3 急性脑中风发生时的炎症介质  91
      4.1.4.4 脑中风发生时的炎症分子机理  91-94
      4.1.4.5 脑中风发生时参与的炎症细胞  94
      4.1.4.6 急性期反应物和体温  94-95
    4.1.5 中风与基因  95
    4.1.6 治疗干预  95-98
      4.1.6.1 目前有效的具有抗炎的药物  96
      4.1.6.2 最新的治疗化合物与治疗方法  96-98
  4.2 中风后血管新生  98-101
    4.2.1 血管生成相关因子  98-101
      4.2.1.1 血管内皮生长因子(VEGF)  98-99
      4.2.1.2 胎盘生长因子(PLGF)  99
      4.2.1.3 神经菌毛蛋白  99-100
      4.2.1.4 血管生成素/Tie受体系统  100-101
        4.2.1.4.1 Tie受体系统  100
        4.2.1.4.2 血管生成素  100-101
      4.2.1.5 促红细胞生成素(Epo)  101
      4.2.1.6 一氧化氮合酶  101
  4.3 结论  101-102
  4.4 参考文献  102-115
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  115-118
致谢  118

8-氧乙酰山栀酸甲酯抗脑缺血及促血管新生研究

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