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环介导等温扩增（LAMP）技术快速检测灿烂弧菌的研究

作　者: 孙秀娟
导　师: 刘均洪
学　校: 青岛科技大学
专　业: 药物化学
关键词: 灿烂弧菌 快速检测 环介导等温扩增
分类号: S947.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


灿烂弧菌(Vibrio splendidus)是养殖刺参的主要致病菌之一,可引起刺参腐皮综合症,死亡率高达90%,还可引起养殖牙鲆、大菱鲆、鳟鱼、大西洋鲑、鲈鱼等的多种疾病。目前针对灿烂弧菌的检测方法包括基于细菌培养的常规检测技术(涂布平板法,生理生化指标鉴定等),基于抗原抗体反应的免疫学方法(玻片凝集法,双抗夹心ELISA, Dot-ELISA,间接荧光检测等)和基于DNA检测的分子生物学方法(PCR法,核酸探针杂交等)。这些方法具有步骤繁琐、所需设备昂贵、耗时长、对操作人员的技术要求较高等特点,一定程度上限制了其在海水养殖基层的应用推广。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是2000年由Notomi开发出的一种新型的核酸扩增技术。其利用特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在等温条件下进行基因高效扩增,具有操作简单、成本低廉、快速高效等优点,已在许多人类疾病的检测和诊断中应用。利用LAMP技术,建立、完善一种快速高效、简便易行的灿烂弧菌检测方法,进行灿烂弧菌病的预防和现场快速诊断,减少、减轻因灿烂弧菌感染所造成的经济损失,对海水养殖业的健康发展具有较好的经济和社会意义。本研究通过生物信息学分析,参照弧菌毒力因子数据库(VFDB)和GenBank中灿烂弧菌的基因组信息,筛选用于LAMP引物设计的灿烂弧菌中潜在的毒力相关基因,通过蛋白保守区域分析和基因同源比对,利用在线引物设计程序设计引物并合成。结合实验分析,选定灿烂弧菌鞭毛相关基因flgF进行条件优化,检测了LAMP反应体系中dNTP、Betaine、Mg2+浓度以及反应时间对LAMP的影响,优化并确定了最佳反应条件。以PCR为对照,分析了LAMP法检测灿烂弧菌的特异性和灵敏度,并对比了几种LAMP结果的肉眼分析方法。为开发基于LAMP技术的海水养殖中灿烂弧菌快速检测试剂(盒)奠定基础。本研究获得的实验结果如下：1、用于灿烂弧菌LAMP’快速检测的引物为：正向外引物F3:5’-GGATCGCGCACTGTTTCT-3’反向外引物B3:5’-TGTGCGAAATTATGACCCGG-3’正向内引物FIP：5’-ACCCGTTGTACTTACGTTGGCAGCCATGAGTGGCGCTAAG-3’反向内引物BIP：5’-AGCACAAGCACGTTCAATGC AACCGTCATGCTGAAAACACGA-3’;2、最佳反应体系：F3和B3,0.2HM; FIP和BIP,1.6μM; dNTP,1.0mM; Betaine,0.1M; Mg2+,5.0mM;模板1μL; Bst DNA聚合酶缓冲液(10×),2.5μL；Bst DNA聚合酶(大片段)为8U,加水补至25μL。最佳反应时间为30min-45min。3、特异性分析：对16株待测菌株培养物和DNA检测中,灿烂弧菌的阳性检出率为100%,与其他菌株未出现明显的交叉反应。4、灵敏度分析：检测灿烂弧菌基因组DNA的最低限度为38fg/μL,检测灿烂弧菌纯培养物的最低限度为1.3×103cfu/mL,均高于常规PCR两个数量级。5、结果判读：Calcein-Mn2+可实现结果的闭管快速判读。利用环介导等温扩增技术(LAMP)检测灿烂弧菌的方法具有特异性好,灵敏度高,反应迅速,结果易判读等优点,具有一定的应用开发价值。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
1 绪论  11-30
  1.1 研究背景及意义  11-12
  1.2 灿烂弧菌简介  12-14
    1.2.1 灿烂弧菌生物学性状及致病性  12-13
    1.2.2 灿烂弧菌的毒力因子  13-14
  1.3 灿烂弧菌检测方法研究现状  14-16
    1.3.1 Dot-ELISA  14
    1.3.2 间接荧光抗体快速检测法(IFAT)  14-15
    1.3.3 PCR法检测  15-16
    1.3.4 核酸探针检测技术  16
  1.4 环介导等温扩增(LAMP)技术概述  16-29
    1.4.1 LAMP的技术特点  17-18
    1.4.2 LAMP方法的引物设计  18-19
    1.4.3 LAMP的反应原理  19-22
    1.4.4 LAMP反应产物的检测方法  22-24
    1.4.5 LAMP方法的研究应用实例  24-29
  1.5 研究内容  29-30
2 材料与方法  30-46
  2.1 试验材料  30-34
    2.1.1 试验菌株  30-31
    2.1.2 设备与软件  31-32
    2.1.3 主要试剂  32-33
    2.1.4 培养基的配制  33
    2.1.5 主要生化试剂的配方  33-34
  2.2 实验方法  34-37
    2.2.1 实验菌株的保藏、活化和培养  34-35
    2.2.2 稀释平板法菌落计数  35
    2.2.3 细菌基因组DNA的提取  35-37
  2.3 灿烂弧菌的鉴定  37-38
    2.3.1 细菌的显微镜观察  37
    2.3.2 细菌的生理生化指标鉴定  37
    2.3.3 灿烂弧菌的16S rDNA检测  37-38
    2.3.4 灿烂弧菌致病性分析  38
  2.4 引物设计和操作程序  38-39
    2.4.1 灿烂弧菌潜在毒力相关基因的筛选  38
    2.4.2 LAMP引物设计  38-39
    2.4.3 LAMP和PCR的操作程序  39
  2.5 反应引物的特异性分析  39-40
    2.5.1 LAMP法检测引物特异性  39-40
    2.5.2 PCR法检测引物特异性  40
  2.6 LAMP反应条件的优化  40-43
    2.6.1 dNTP浓度的优化  40-41
    2.6.2 Betaine浓度的优化  41
    2.6.3 Mg~(2+)浓度的优化  41-42
    2.6.4 反应时间的优化  42-43
  2.7 检测灿烂弧菌的灵敏度测定  43-44
    2.7.1 LAMP法检测灿烂弧菌基因组DNA的灵敏度测定  43
    2.7.2 常规PCR法检测灿烂弧菌基因组DNA的灵敏度测定  43
    2.7.3 LAMP法检测灿烂弧菌纯培养的灵敏度测定  43
    2.7.4 常规PCR法检测灿烂弧菌纯培养的灵敏度测定  43-44
  2.8 LAMP的扩增产物分析  44-46
    2.8.1 LAMP的扩增产物的可视结果分析  44
    2.8.2 LAMP扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析  44
    2.8.3 LAMP扩增产物的SYBR Green Ⅰ荧光分析  44
    2.8.4 LAMP扩增产物的新型荧光指示剂Calcein-Mn~(2+)分析  44-46
3 结果与分析  46-67
  3.1 灿烂弧菌的培养、鉴定及基因组DNA的提取  46-53
    3.1.1 灿烂弧菌培养及显微镜观察  46-47
    3.1.2 灿烂弧菌的生理生化指标鉴定  47-50
    3.1.3 灿烂弧菌的16S rDNA分析  50-51
    3.1.4 灿烂弧菌的致病性实验结果  51-52
    3.1.5 细菌基因组DNA的提取结果  52-53
  3.2 灿烂弧菌潜在毒力相关基因的筛选和引物设计  53-55
    3.2.1 灿烂弧菌潜在毒力相关基因的筛选  53-54
    3.2.2 LAMP引物设计  54-55
  3.3 引物特异性分析  55-56
    3.3.1 LAMP法检测引物特异性  55
    3.3.2 PCR法检测引物特异性  55-56
  3.4 LAMP反应条件的优化  56-59
    3.4.1 dNTP浓度对LAMP反应的影响  56
    3.4.2 Betaine浓度对LAMP反应的影响  56-57
    3.4.3 Mg~(2+)浓度对LAMP反应的影响  57-58
    3.4.4 反应时间对LAMP反应的影响  58-59
    3.4.5 LAMP反应的最佳反应体系  59
  3.5 检测灿烂弧菌的灵敏度研究  59-63
    3.5.1 LAMP法检测灿烂弧菌基因组DNA的灵敏度  59-61
    3.5.2 常规PCR法检测灿烂弧菌基因组DNA的灵敏度  61
    3.5.3 LAMP法检测灿烂弧菌纯培养的灵敏度  61-63
    3.5.4 常规PCR法检测灿烂弧菌纯培养的灵敏度  63
  3.6 LAMP扩增产物分析  63-67
    3.6.1 LAMP扩增产物的可视化分析  63-64
    3.6.2 LAMP扩增产物的凝胶电泳分析  64-65
    3.6.3 LAMP扩增产物的SYBR Green Ⅰ荧光分析  65-66
    3.6.4 LAMP扩增产物的新型荧光指示剂Calcein-Mn~(2+)分析  66-67
4 讨论  67-74
  4.1 环介导等温扩增(LAMP)法检测灿烂弧菌的方法学评价  67-68
  4.2 环介导等温扩增(LAMP)法的目的基因筛选及引物设计策略  68-69
  4.3 环介导等温扩增(LAMP)法的条件优化  69
  4.4 环介导等温扩增(LAMP)法的模板DNA的获取  69-70
  4.5 环介导等温扩增(LAMP)法的结果检测  70
  4.6 环介导等温扩增(LAMP)法检测灿烂弧菌的灵敏度比较  70
  4.7 环介导等温扩增(LAMP)法的注意事项  70-74
5 结论及展望  74
参考文献  74-80
致谢  80-81
攻读学位期间发表的学术论文  81-83

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 其他水产病虫害及其防治 > 其他
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