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玉米基因组DNA提取测定及转植酸酶基因检测方法的研究

作　者: 陈丽丽
导　师: 张鹏
学　校: 北京化工大学
专　业: 化学工程与技术
关键词: 基因组DNA提取浓度测定转植酸酶基因环介导等温扩增(LAMP) 聚合酶链式反应(PCR) 检测方法
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

随着转基因作物商品化的迅猛发展,转基因作物已经深入生活,为社会、经济、环境的和谐发展创造出巨大的效益。但就转基因作物的安全性问题仍然存在很多争议,各国政府也纷纷出台了一系列有关转基因及其产品的管理、规定和法规,要求对转基因及其产品进行标签,标明其是否为转基因产品,甚至对转基因成分的含量进行限制。目前,有许多未经标签的转基因作物及其加工产品进入我国市场,这就迫切需要针对转基因作物中含量较低的转基因成分,通过对DNA提取、浓度测定及转基因成分检测方法的研究,建立一种快速、简便、高效的检测方法。本课题首先以玉米种子为材料,对改良的CTAB法、离心柱法(TIANGEN)、离心柱法(QIAGEN)、磁珠法(Promega)4种基因组DNA提取方法以及紫外分光光度法、Qubit荧光法、Pico Green荧光分光光度法3种DNA浓度测定方法进行评价分析；其次以转植酸酶基因玉米为材料,构建植酸酶基因标准质粒,建立玉米中转植酸酶基因的PCR检测方法；最后设计并筛选出检测玉米中转植酸酶基因的LAMP反应引物,建立玉米中转植酸酶基因的LAMP定量检测方法,构建植酸酶基因LAMP检测标准曲线。主要研究成果如下：(1)磁珠法(Promega)能有效获得纯度高、完整性好的基因组DNA,并且重复性好,提取得率高,达到813.7 ng/100mg,提取时间短,可在1小时内完成；在基因组DNA浓度测定中,紫外分光光度法、Qubit荧光法、Pico Green荧光分光光度法的相对误差分别为99.8%、49.8%、28.9%,Pico Green荧光分光光度法的准确度最高。(2)通过基因克隆,获得了合格的植酸酶基因标准质粒；确立了PCR检测的最优反应体系及反应条件,特异性和灵敏度实验表明PCR引物具有很好的特异性,灵敏度为1000拷贝数,建立了玉米中转植酸酶基因的PCR检测方法。(3)设计并筛选出1组用于LAMP检测植酸酶基因的引物,确立了LAMP检测的最优反应体系及反应条件,特异性和灵敏度实验表明PCR引物具有很好的特异性,灵敏度为30拷贝数,建立了玉米中转植酸酶基因的LAMP检测方法；构建了植酸酶基因LAMP检测标准曲线,标准曲线相关系数R2达到0.996,对植酸酶基因的检测限为60拷贝数。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-14
第一章文献综述  14-28
  1.1 研究背景  14-15
  1.2 植物基因组DNA提取及浓度测定技术  15-17
    1.2.1 植物基因组DNA提取技术  15-16
    1.2.2 DNA浓度测定方法  16-17
  1.3 聚合酶链式反应(PCR)技术  17-18
    1.3.1 定性PCR技术原理  17
    1.3.2 PCR反应产物检测方法  17-18
    1.3.3 PCR技术发展历史及研究现状  18
  1.4 实时荧光定量PCR技术  18-20
    1.4.1 实时荧光定量PCR技术原理  19
    1.4.2 实时荧光定量PCR技术应用  19-20
  1.5 环介导等温扩增技术  20-26
    1.5.1 环介导等温扩增技术概述  20
    1.5.2 环介导等温扩增技术的引物设计  20-21
    1.5.3 环介导等温扩增方法的基本原理  21-24
    1.5.4 环介导等温扩增产物的检测方法  24
    1.5.5 环介导等温扩增方法的应用  24-26
  1.6 转植酸酶基因玉米  26
  1.7 研究内容及拟解决的关键问题  26-28
    1.7.1 研究内容  26-27
    1.7.2 拟解决的关键问题  27-28
第二章玉米基因组DNA提取及浓度测定方法的评价研究  28-42
  2.1 实验材料  28-30
    2.1.1 植物材料及标准品  28
    2.1.2 引物及探针合成  28-29
    2.1.3 实验试剂  29
    2.1.4 实验仪器与设备  29-30
  2.2 实验方法  30-35
    2.2.1 本实验使用溶液配制方法  30
    2.2.2 玉米种子基因组DNA提取方法  30-32
    2.2.3 基因组DNA提取产物检测方法  32-33
    2.2.4 玉米样品DNA浓度测定方法  33-35
  2.3 结果与讨论  35-39
    2.3.1 基因组DNA的检测  35-37
    2.3.2 基因组DNA提取方法重复性及提取时间比较  37
    2.3.3 三种方法测定玉米样品DNA浓度结果  37-39
  2.4 本章小结  39-42
第三章玉米中转植酸酶基因的聚合酶链式反应方法的研究  42-56
  3.1 实验材料  42-43
    3.1.1 植物材料  42
    3.1.2 引物合成及基因序列测定  42
    3.1.3 实验试剂  42-43
    3.1.4 实验仪器与设备  43
  3.2 实验方法  43-47
    3.2.1 转植酸酶基因玉米基因组DNA的提取  44
    3.2.2 玉米中转植酸酶基因的克隆和序列测定  44-46
    3.2.3 PCR引物设计  46
    3.2.4 PCR扩增条件优化  46-47
    3.2.5 PCR反应产物检测方法  47
    3.2.6 PCR反应引物特异性检测  47
    3.2.7 PCR反应灵敏度检测  47
  3.3 结果与讨论  47-54
    3.3.1 基因组DNA提取结果分析  47-48
    3.3.2 玉米中转植酸酶基因克隆结果分析  48-49
    3.3.3 PCR扩增条件优化结果分析  49-52
    3.3.4 PCR引物特异性分析  52-53
    3.3.5 PCR检测灵敏度分析  53-54
  3.4 本章小结  54-56
第四章玉米中转植酸酶基因的环介导等温扩增方法的研究  56-76
  4.1 实验材料  56-58
    4.1.1 植物材料  56
    4.1.2 引物合成及基因序列测定  56
    4.1.3 实验试剂  56-57
    4.1.4 实验仪器与设备  57-58
  4.2 实验方法  58-62
    4.2.1 本实验使用溶液配制方法  58
    4.2.2 LAMP引物设计  58-59
    4.2.3 LAMP反应条件优化  59-60
    4.2.4 LAMP反应产物检测方法  60-61
    4.2.5 LAMP反应特异性检测  61-62
    4.2.6 LAMP反应灵敏度检测  62
    4.2.7 LAMP反应标准曲线构建  62
  4.3 结果与讨论  62-73
    4.3.1 LAMP反应引物筛选结果  62-63
    4.3.2 LAMP反应条件优化结果分析  63-69
    4.3.3 LAMP反应产物检测结果分析  69-70
    4.3.4 LAMP反应特异性检测结果分析  70-73
  4.4 本章小结  73-76
第五章结论  76-78
  5.1 结论  76-77
  5.2 创新点  77
  5.3 下一步工作与建议  77-78
参考文献  78-82
致谢  82-83
研究成果及发表的学术论文  83-84
作者和导师简介  84-85
附录  85-86

玉米基因组DNA提取测定及转植酸酶基因检测方法的研究

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