学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

灿烂弧菌的鉴定及溶血素检测

作　者: 王亮
导　师: 常维山；刁有祥
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 灿烂弧菌 致病性 溶血素 原核表达 免疫中和试验
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 69次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


海水养殖动物的弧菌病（Vibrio）是一种流行范围广,危害严重的传染性疾病。其中灿烂弧菌是致病菌之一。灿烂弧菌是海水动物的重要致病菌,可引发大菱鲆、牙鲆、大西洋鲑、鳟鱼、鲈鱼等患多种疾病,可引起尾部有出血点,皮肤腐烂,严重的形成溃疡;背鳍、胸鳍、尾鳍的鳍条基部充血;肝脏肿大,糜烂;肾脏糜烂等症状。还可引起刺参腐皮综合征。弧菌溶血素被认为是主要的致病因子之一。但是,针对于灿烂弧菌致病因子的相关研究报道较少。国外曾有针对灿烂弧菌的金属蛋白酶缺失自杀载体的试验研究报道,但以灿烂弧菌的溶血素基因4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase（4HPPD）为对象的研究尚未见报道。本研究以纯化的灿烂弧菌外毒素和灿烂弧菌溶血素基因4HPPD原核表达蛋白为对象,以此菌致病的致病因子进行了分析。获得的结果如下:1青岛某美国红鱼养殖场中患溃烂症的美国红鱼分离到优势菌株QD-1,人工感染实验证实该菌为美国红鱼的致病菌。对该细菌进行了形态学、生理生化特性分析,同时对菌株QD-1进行了分子生物学的鉴定,命名为灿烂弧菌QD-1菌株（Vibrio splendidus QD-1）。2细菌致病性的检测:溶血性测定:将脱纤维羊血按5%的体积加入Zobell 2216E海洋培养基中制成羊鲜血平板,28℃过夜培养。菌落周围出现半径为2mm溶血环。磷脂酶活性测定:配制Zobell 2216E固体培养基,加入体积分数为1%的新鲜蛋黄,制成平板。在菌落周围出现半径为0.5mm乳白色半透明圈。从以上两个实验中可以看到灿烂弧菌的溶血性较强,而磷脂酶的活性测较弱,这可能是与菌株的不同有关。人工感染实验:在水族箱中,每箱放养健康孔雀鱼10尾。致病性试验共分6组,5个实验组和1个对照组,每组10尾鱼,实验组的细菌浓度分别为2×104 cfu /mL,2×105 cfu /mL,2×106 cfu /mL,2×107 cfu /mL,2×108 cfu /mL,对照组为0.65%的灭菌生理盐水,采用腹腔注射,注射剂量0.20 mL/尾。饲养水温27.4℃-28℃,连续观察7 d,随时记录鱼的发病症状及死亡情况。应用简易Korbor’s法计算出LD50为5.62×105 cfu/mL。3灿烂弧菌挑取单个菌落接种50mL海水培养基中,于28℃增菌18h后,再按1%量转种至1L海水培养基中,200rpm,振荡48h。硫酸铵沉淀:培养物经离心取上清加入固体硫酸铵至70%的饱和度,离心后用浓度为50mmol/L的Tris-HCL （pH=7.8）缓冲液溶解,用相同缓冲液4℃透析48h,将其浓缩后即为粗提外毒素。Sephadex-G100层析:粗提外毒素加入Sephadex-G100层析柱中,用缓冲液洗脱,流速为6滴/min,每2mL收集一管,测定OD值,将最高峰值处的蛋白收集液,用PEG-100浓缩,即为纯化外毒素。经SDS-PAGE法测得分子量为40.7 kD。通过考马斯亮蓝法测得纯化蛋白的含量为0.8 mg/mL。取提纯溶血素作原液,10,100,1000倍稀释后无菌过滤,分四组。每一稀释度腹腔注射孔雀鱼5尾,每尾注射0.1mL,室温观察48h,记录实验鱼死亡数,按简易Korbor’s法计算LD50为6.35μg。结果表明,这是一株有致病性的灿烂弧菌。4将溶血素基因4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase （4HPPD）构建于表达载体pGEX-6P-I,经过一系列的条件摸索后,最终确定加入IPTG至终浓度0.8mmol/L,30℃,200rpm,振荡4h为最佳诱导条件。将纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多抗,将QD-1菌株纯化外毒素抗原稀释至16ug/mL,抗体稀释160倍测得P/N比值最大（阳性血清OD值为0.591,阴性对照值为0.058）。P/N=10。通过间接ELISA测定,免疫小鼠抗溶血素抗体滴度为1:3200。中和溶血素试验根据,将溶血素无菌过滤后分别分成10,100倍稀释组和纯化溶血素原液组,分别与20倍稀释免疫小鼠血清等量混合,室温作用1h。接种混合物的孔雀鱼,原液组全部死亡,10倍稀释抗原组死亡两尾,100倍稀释抗原组死亡1尾。

全文目录


中文摘要  9-11
英文摘要  11-14
1前言  14-24
  1.1 海水养殖及其细菌性病害  14-15
  1.2 病原弧菌的致病机理  15-19
    1.2.1 粘附相关因子  15-17
    1.2.2 铁离子利用  17-19
  1.3 荚膜  19
  1.4 内毒素  19-20
  1.5 胞外产物  20-23
    1.5.1 胞外蛋白酶  20
    1.5.2 溶血素  20-21
    1.5.3 细胞溶素  21
    1.5.4 肠毒素  21-22
    1.5.5 不耐热性肠毒素  22
    1.5.6 耐热性肠毒素  22
    1.5.7 封闭带毒素  22
    1.5.8 副霍乱毒素  22-23
  1.6 研究的目的和意义  23-24
2 材料与方法  24-44
  2.1 材料  24-27
    2.1.1 菌株  24
    2.1.2 转化菌株和质粒  24
    2.1.3 试剂  24-27
      2.1.3.1 生物试剂  24
      2.1.3.2 培养基配制  24
      2.1.3.3 化学试剂  24-27
  2.2 方法  27-44
    2.2.1 灿烂弧菌的鉴定及致病性检测  27-28
      2.2.1.1 生理生化试验  27
      2.2.1.2 分子生物学鉴定  27-28
      2.2.1.3 溶血性和磷脂酶活性试验及人工感染实验(LD50)  28
    2.2.2 灿烂弧菌外毒素的提纯  28-31
      2.2.2.1 灿烂弧菌QD-1  28
      2.2.2.2 灿烂弧菌QD-1 菌株外毒素的提取准备  28-29
      2.2.2.3 葡聚糖交换层析柱的装柱  29
      2.2.2.4 细菌外毒素的提取  29-30
      2.2.2.5 外毒素蛋白浓度测定  30-31
    2.2.3 外毒素的LD50 测定  31
    2.2.4 溶血素基因的PCR 扩增  31-36
      2.2.4.1 PCR 模板DNA 的制备  31
      2.2.4.2 溶血素基因的扩增  31
      2.2.4.3 目的条带的回收  31-32
      2.2.4.4 感受态细胞的制备  32
      2.2.4.5 连接T 载体进行测序  32
      2.2.4.6 测序目的片段的处理  32-33
      2.2.4.7 PGEX-6P-I 载体的处理  33-34
      2.2.4.8 目的片段和载体PGEX-6P-I 的连接  34
      2.2.4.9 连接产物的转化  34
      2.2.4.10 阳性克隆的鉴定  34-35
      2.2.4.11 测序鉴定正确的阳性表达质粒转化至E.coli BL21（DE3）  35-36
    2.2.5 4HPPD 基因表达  36-39
      2.2.5.1 诱导物浓度选择  36
      2.2.5.2 重组表达蛋白的鉴定  36-37
      2.2.5.3 重组蛋白的提取、纯化  37-39
    2.2.6 Western-Blot 免疫印迹  39-40
    2.2.7 考马斯亮蓝法测定纯化蛋白的浓度  40
    2.2.8 重组蛋白生物活性测定  40
    2.2.9 制备小鼠抗4HPPD 蛋白抗血清  40-41
    2.2.10 检测三免后血清抗体效价  41-43
      2.2.10.1 间接ELISA 方法的基本操作程序  41-42
      2.2.10.2 抗原最佳包被浓度以及血清最佳稀释度的选择  42
      2.2.10.3 二抗稀释度的选择  42
      2.2.10.4 显色时间的选择  42-43
    2.2.11 纯化外毒素与免疫小鼠血清的ELISA 检测  43
      2.2.11.1 抗原最佳包被浓度以及血清最佳稀释度的选择  43
    2.2.12 QD-1 菌株纯化外毒素免疫小鼠产生抗体与纯化的重组蛋白 Western-Blot 检测  43
    2.2.13 溶血素中和试验  43-44
3 结果  44-58
  3.1 灿烂弧菌的鉴定及致病性检测  44-49
    3.1.1 生化试验  44
    3.1.2 扩增结果  44-48
    3.1.3 溶血性和磷脂酶活性试验及人工感染实验的结果  48-49
      3.1.3.1 羊血平板  48
      3.1.3.2 磷脂酶活性测定  48-49
      3.1.3.3 人工感染实验及灿烂弧菌的半数致死量  49
  3.2 灿烂弧菌外毒素的提纯  49-50
    3.2.1 最佳硫酸铵饱和度的选择  49-50
    3.2.2 细菌外毒素的提取  50
    3.2.3 外毒素蛋白浓度测定  50
  3.3 外毒素的LD50 测定  50-51
  3.4 重组表达质粒的构建与鉴定  51-54
    3.4.1 溶血素基因的PCR 扩增  51-53
    3.4.2 PGEX-6P-I 载体的处理  53
    3.4.3 重组表达质粒的构建与鉴定  53-54
  3.5 蛋白表达  54-55
    3.5.1 条件的优化结果  54-55
    3.5.2 重组蛋白的复性及纯化  55
    3.5.3 重组蛋白浓度测定  55
  3.6 Western-Blot 免疫印迹  55-56
  3.7 重组蛋白生物活性测定:  56
  3.8 检测三免后血清抗体效价  56
    3.8.1 间接 ELISA 试验条件的优化  56
    3.8.2 纯化外毒素与免疫小鼠血清的 ELISA 检测  56
  3.9 QD-1 菌株与纯化的重组蛋白 Western-Blot 检测结果  56-57
  3.10 溶血素中和试验  57-58
4 讨论  58-63
5 结论  63-64
参考文献  64-75
致谢  75-76
研究生期间发表论文  76-77
硕士学位论文内容简介及自评  77

相似论文

  1. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  2. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  3. 稻瘟病菌转录因子Moswi6的功能研究,S435.111.4
  4. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  5. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  6. 小麦黄花叶病毒（WYMV）RNA2编码基因的功能研究,S435.121
  7. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  8. 羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定,S852.61
  9. 猪链球菌2型与猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程亚单位疫苗的研究,S858.28
  10. 鸡源禽致病性大肠杆菌分离鉴定及其毒力相关基因分布特征分析,S852.61
  11. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析,S852.65
  12. 猪细小病毒河南流行株的分离、鉴定及部分生物学特性研究,S852.65
  13. 人源β-防御素-6的原核表达及纯化,Q78
  14. 圆眼珍珠蛙（Lepidobatrachus laevis）皮肤cDNA文库的构建、筛选及胰蛋白酶抑制剂的原核表达和活性研究,Q78
  15. 新型菊酯类农药降解酶的生化鉴定及分子改造研究,X172
  16. 棉铃虫与烟夜蛾寄主选择机制的比较研究,S435.622.3
  17. 草鱼NCCRP-1和IL-10基因的克隆和表达,S917.4
  18. 鲤鱼肠道sglt1的表达与抗体制备,S917.4
  19. 牛骨髓Cathelicidin类抗菌肽的克隆及表达,S858.23
  20. 洋葱鳞茎细菌性软腐病病原及农业措施防控技术,S436.33
  21. 蟹多拷贝串联重组金属硫蛋白基因的原核表达载体构建及表达,Q78

中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
© 2012 www.xueweilunwen.com