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斑点叉尾鮰呼肠孤病毒诱导斑点叉尾鮰肾脏组织细胞凋亡的研究

作　者: 王瑶
导　师: 曾令兵
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 斑点叉尾鮰出血病呼肠孤病毒斑点叉尾鮰肾脏细胞系细胞凋亡
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

湖北某斑点叉尾鮰苗种场暴发斑点叉尾鮰出血病,患病鱼症状为鳍条基部、下颌、鳃盖、眼眶周围出血,眼球突出,腹部膨胀。肝、肾失血,脾脏肿大,呈黑红色。肌肉组织有出血瘀点。该病主要危害体长6-14cm的斑点叉尾鮰鱼种,死亡率高达60%以上,造成严重经济损失。斑点叉尾鮰出血病的病原为斑点叉尾鮰呼肠孤病毒,属水生呼肠孤病毒属成员。本研究建立了斑点叉尾鮰呼肠孤病毒的培养方法,该病毒可感染斑点叉尾鮰肾脏细胞系并稳定传代,病毒滴度较高为10-8-67/m1。通过病毒滴度测定,证明反复冻融对病毒滴度无明显影响(P>0.05)。本研究查明了斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)感染斑点叉尾鮰肾脏细胞(CCK)诱导其发生凋亡的机理。以CCRV感染的CCK细胞为实验材料,采用Hoechst33258染色、DNA片段化检测、TUNEL反应、亚G1期细胞检测以及线粒体膜电位变化检测等方法进行实验。感染试验结果显示,病毒感染斑点叉尾鮰肾脏组织细胞后,细胞变圆、皱缩、折光度增加,随后细胞脱落,细胞单层呈网状,感染72h后出现典型细胞病变效应(CPE)；病毒感染72h后Hoechst33258染色结果显示,细胞的染色质固缩、核边缘化或破裂,可观察到凋亡小体,细胞凋亡率随时间增加；DNA片段化检测结果显示,病毒感染细胞12h后细胞基因组DNA出现片段化,随后逐渐增强,72h达到最高；YIINEL反应结果表明,病毒感染细胞72h后细胞基因组DNA断裂,有大量游离3’末端自由羟基(-OH)存在。亚G1期细胞检测结果显示,病毒感染48h后,约53.44%细胞处于亚G1期；利用JC-1检测试剂盒检测病毒感染细胞的线粒体膜电位变化,病毒感染细胞24h后线粒体膜通透性发生改变,膜电位变化显著。紫外线灭活与热灭活的斑点叉尾鮰呼肠孤病毒不能诱导斑点叉尾鮰肾脏细胞发生凋亡,表明细胞凋亡依赖于病毒复制。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-10
缩略语表  10-12
第一章文献综述  12-24
  1. 斑点叉尾鮰呼肠孤病毒研究概况  12-14
    1.1 斑点叉尾鮰出血病的症状及流行特征  12
    1.2 斑点叉尾鮰呼肠孤病毒的特征  12-13
    1.3 斑点叉尾鮰呼肠孤病毒病的诊断  13-14
      1.3.1 组织病理学诊断  13
      1.3.2 细胞培养法分离鉴定病毒  13-14
      1.3.3 超微病理学技术检测  14
      1.3.4 分子生物学检测方法  14
  2. 细胞凋亡  14-21
    2.1 细胞凋亡的概念  14-15
    2.2 细胞凋亡的形态以及生化特征  15-16
    2.3 细胞凋亡的发生机制  16
    2.4 细胞凋亡过程中相关凋亡因子  16-18
      2.4.1 Caspase家族  17
      2.4.2 原癌基因及抑癌基因  17
      2.4.3 病毒基因  17-18
    2.5 细胞凋亡的检测  18-21
      2.5.1 形态学观察  18
      2.5.2 DNA片段化分析  18-19
      2.5.3 TUNEL分析法  19
      2.5.4 Caspase-3活性的检测  19
      2.5.5 线粒体膜势能的检测  19-20
      2.5.6 流式细胞术  20
      2.5.7 其他方法  20-21
  3. 病毒感染与细胞凋亡的研究现状  21-22
    3.1 病毒感染与细胞凋亡的关系  21
    3.2 病毒调节细胞凋亡的途径  21-22
      3.2.1 经免疫系统介导凋亡  21-22
      3.2.2 病毒直接调节凋亡  22
    3.3 病毒引起细胞凋亡的意义  22
  4. 本论文研究的目的及意义  22-24
第二章斑点叉尾鮰呼肠孤病毒的分离与培养方法  24-35
  1 实验材料与方法  24-29
    1.1 材料  24-25
      1.1.1 患病鱼和细胞系  24
      1.1.2 主要试剂  24-25
      1.1.3 主要仪器与设备  25
    1.2 方法  25-29
      1.2.1 CCK细胞复苏  25-26
      1.2.2 CCK细胞传代  26
      1.2.3 病毒分离  26
      1.2.4 病毒接种  26-27
      1.2.5 电镜观察  27
      1.2.6 病毒滴度(TCID_(50))测定  27-28
      1.2.7 病毒对冻融的敏感性  28-29
  2 结果  29-33
    2.1 正常CCK细胞观察  29
    2.2 病理症状观察  29-30
    2.3 细胞病变观察  30
    2.4 超微结构观察  30-31
    2.5 病毒培养特性  31
    2.6 病毒滴度TCID_(50)测定  31-32
    2.7 冻融对病毒滴度的影响  32-33
  3 讨论  33-34
    3.1 CCK细胞的生长  33-34
    3.2 病毒的培养特性  34
    3.3 冻融处理对病毒的影响  34
  4 小结  34-35
第三章斑点叉尾鮰呼肠孤病毒诱导CCK细胞凋亡  35-48
  1 实验材料与方法  35-38
    1.1 材料  35-36
      1.1.1 毒株和细胞系  35
      1.1.2 主要试剂  35-36
      1.1.3 主要仪器与设备  36
    1.2 实验方法  36-38
      1.2.1 CCK的培养  36
      1.2.2 CCRV病毒感染  36-37
      1.2.3 Hoechst 33258荧光染色  37
      1.2.4 DNA Ladder试验  37
      1.2.5 TUNEL检测  37-38
      1.2.6 亚G_1期(sub-G1)细胞检测  38
      1.2.7 JC-1检测线粒体膜电位变化  38
      1.2.8 灭活CCRV诱导CCK凋亡试验  38
  2 实验结果  38-44
    2.1 CCK细胞病变效应  38-39
    2.2 HOECHST 33258荧光染色  39-40
    2.3 DNALADDER试验  40-41
    2.4 TUNEL检测  41-42
    2.5 亚G_1期(suB-G1)细胞检测  42-43
    2.6 流式细胞仪JC-1检测  43
    2.7 灭活CCRV诱导CCK凋亡  43-44
  3 讨论  44-47
    3.1 CCRV诱导的细胞凋亡形态学变化  45
    3.2 CCRV诱导的细胞凋亡生化特征变化  45-46
    3.3 流式细胞术在细胞凋亡检测中应用  46-47
    3.4 CCRV诱导CCK细胞凋亡与病毒核酸复制  47
  4 小结  47-48
参考文献  48-57
附录  57-58
致谢  58

斑点叉尾鮰呼肠孤病毒诱导斑点叉尾鮰肾脏组织细胞凋亡的研究

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