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农杆菌质粒Ti介导的藓羽藻基因转化研究

作　者: 徐美玲
导　师: 王广策
学　校: 天津科技大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 藓羽藻原生质体农杆菌凝集素基因基因转化
分类号: S917.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

藓羽藻是一种多核单细胞海洋绿藻,其原生质体可在海水中发育成为新的个体因此,如果将表达质粒与其原生质体共团聚,则有可能获得携带外源基因的藓羽藻植株。若外源基因整合到藓羽藻染色体就可能很容易地得到转基因藻体。本研究利用藓羽藻原生质体作为外源基因的受体和表达系统,以农业转基因工程中常用的农杆菌Ti质粒作为载体将外源基因转入海藻,试图建立了一种可供选择的藻类基因重组系统。主要研究内容如下1.筛选藓羽藻原生质体团聚过程中活跃表达的基因区段,作为外源基因插入的潜在位点。我们发现藓羽藻中一种凝集素基因在其原生质体团聚过程中起重要作用,利用荧光定量PCR技术对其转录水平,免疫印迹法在蛋白水平上进行了检测,证明其在原生质团聚及发育过程中存在一个先增加后降低的过程。免疫胶体金定位试验结果说明此凝集素在藓羽藻细胞内含量丰富,它既存在于胞质中,也存在于叶绿体的类囊体膜内。推测凝集素能促进原生质体中细胞器的团聚与再生2.采用染色体步移技术获得了凝集素基因的侧翼序列,并在5’非翻译区发现了一段强启动子序列。以凝集素基因、GFP检测基因、凝集素基因3’与5’端各一段非翻译区段作为元件,按照不同的排列次序,将这几种元件组装入pCAMBIA3301质粒,分别构建了四种Ti质粒p3301SLec5’G3’UTR,p3301SGFP, p3301SGFP5’-3’UTR, p3301SGFP5’S3’UTR,经大肠杆菌扩增后,分别回收质粒转入农杆菌。3.培养包含Ti质粒的农杆菌菌株EHA105和LBA4404至OD600=0.3,左右,加入乙酰丁香酮诱导,参考上述藓羽藻原生质团聚体形成及发育过程中凝集素表达变化的结果,在原生质团聚时,加入乙酰丁香酮诱导处理的农杆菌,待团聚体形成6小时至12小时内,每隔1小时,用乙酰丁香酮诱导15分钟的农杆菌处理团聚球10分钟,之后换海水培养原生质团聚球。待原生质体发育成小苗后,荧光显微镜观察新长出的植株,但未监测到绿色荧光蛋白的表达。后提取DNA,以GFP基因设计引物,进行分子鉴定,可惜的是也没有监测到GFP的基因片断,说明GFP基因没有整合到藓羽藻基因组,并不是整合以后的表达沉默。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
1 前言  8-18
  1.1 藓羽藻转基因研究的生物学基础  8-10
    1.1.1 藓羽藻的生物学特性  8
    1.1.2 藓羽藻的生活史  8-9
    1.1.3 藓羽藻原生质体团聚再生的研究进展  9-10
    1.1.4 藓羽藻转基因的研究进展  10
  1.2 藻类基因工程的研究概况  10-12
    1.2.1 原核藻类基因工程研究进展  11
    1.2.2 真核藻类基因工程研究进展  11-12
  1.3 农杆菌介导的基因转化研究进展  12-17
    1.3.1 农杆菌遗传转化的机理  13-14
    1.3.2 农杆菌的宿主范围  14-15
    1.3.3 农杆菌介导转化的方法  15
    1.3.4 影响遗传转化效率的因素  15-17
  1.4 研究内容及其意义  17-18
2 藓羽藻凝集素在原生质体团聚中的功能研究  18-31
  2.1 材料  18
  2.2 实验方法  18-25
    2.2.1 荧光定量PCR检测凝集素在团聚过程中的变化  18-22
    2.2.2 免疫印迹法检测凝集素基因在团聚体不同发育阶段的表达  22-24
      2.2.2.1 凝集素基因的原核表达及抗体制备  22-24
      2.2.2.2 凝集素抗体对藓羽藻原生质体团聚的影响  24
      2.2.2.3 Western Blotting检测凝集素在团聚不同发育阶段的相对表达水平  24
    2.2.3 免疫胶体金检测凝集素在藓羽藻细胞中的分布  24-25
  2.3 实验结果  25-28
    2.3.1 藓羽藻抗血清抑制原生质体的团聚  25
    2.3.2 凝聚素基因在团聚不同发育阶段的转录表达分析  25-26
    2.3.3 凝聚素基因在团聚不同发育阶段的翻译表达分析  26-27
    2.3.4 凝聚素基因的亚细胞定位  27-28
  2.4 讨论  28-31
    2.4.1 细胞器的团聚及抑制机制  28-29
    2.4.2 原生质体各个发育阶段凝集素的相对表达情况  29
    2.4.3 凝集素在藻体中的分布  29-30
    2.4.4 团聚机制的假说  30-31
3 农杆菌介导的藓羽藻基因转化研究  31-45
  3.1 材料  31-33
  3.2 实验方法  33-37
    3.2.1 染色体步移技术扩增凝集素侧翼序列  33-34
    3.2.2 表达载体Ti质粒的构建  34-36
    3.2.3 根瘤农杆菌EHA105的转化  36
    3.2.4 根瘤农杆菌LBA4404的转化  36-37
    3.2.5 农杆菌转染藓羽藻原生质体  37
  3.3 实验结果  37-43
    3.3.1 凝集素基因全序列及侧翼序列  37-39
    3.3.2 Ti质粒的构建  39-43
    3.3.3 不同菌株侵染效果的比较  43
    3.3.4 藓羽藻再生植株标记基因的鉴定  43
  3.4 讨论  43-45
    3.4.1 农杆菌Ti质粒的构建  43-44
    3.4.2 藓羽藻原生质体作为转基因受体的可行性  44
    3.4.3 农杆菌Ti质粒介导的藓羽藻转基因研究可行性分析  44-45
4 展望  45-46
5 参考文献  46-54
6 攻读硕士学位期间发表论文情况  54-55
7 致谢  55

农杆菌质粒Ti介导的藓羽藻基因转化研究

内容摘要

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