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家蚕性信息素生物合成相关基因的分子鉴定

作　者: 张松斗
导　师: 安世恒
学　校: 河南农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 家蚕 性信息素 PBAN PBANR 保幼激素 Met Lipase Real-Time PCR RNAi GC/MS 原核表达 Western blot
分类号: S881.26
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 62次
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内容摘要


性信息素是雌成虫释放到体外用来吸引异性、快速寻找配偶并繁殖后代的关键因子，其合成和释放主要靠一类神经肽——信息素合成激活肽（Pheromone Biosynthesis ActivatingNeuropeptide，PBAN）来控制。PBAN的作用机制一般认为首先通过与性信息素腺体细胞膜表面的受体结合，经过一系列的信号转导，最终导致性信息素的合成与释放。性信息素合成的机制在不同昆虫中也有差异，目前对性信息素合成机制的研究主要集中在家蚕（Bombyxmori）和美洲棉铃虫（Helicoverpa zea）中。在家蚕中，PBAN和性信息素腺体（pheromonegland，PG）细胞表面的PBAN受体（PBAN receptor，PBANR）特异性结合激活了蚕蛾醇生物合成过程中的一系列关键性酶的活性，并作用于蚕蛾醇前体三酯酰甘油的脂解和脂肪酰基还原等过程而促进性信息素产物的最终合成。本文的研究内容主要包括：家蚕性信息素腺体PBANR基因的分子鉴定；交配对家蚕雌蛾性信息素腺体内基因表达的影响；保幼激素（Juvenile hormone，JH）过量表达对蚕蛾醇产量的影响；RNAi介导的家蚕Met1基因的沉默对蚕蛾醇产量的影响；家蚕性信息素腺体胰腺脂肪酶类似基因（B. mori pancreatic lipase-like gene，BmPLLG）的时空表达分析；RNAi介导的BmPLLG基因的沉默对蚕蛾醇产物的影响；BmPLLG基因的分子克隆和多克隆抗体的制备以及家蚕不同发育时期BmPLLG蛋白的Western blot检测。主要结论如下：1.家蚕性信息素腺体PBANR基因的分子鉴定生物信息学分析表明，家蚕PBANR基因的cDNA序列大小为2780bp，编码框为1242bp，编码413个氨基酸残基，预测蛋白分子量为45.9KD，等电点PI为9.82，与其它昆虫PBANR基因的氨基酸序列的一致性较高。发育表达分析显示，PBANR基因从羽化前96h开始表达，一直持续到羽化后48h仍呈稳定增长趋势，其表达模式具有明显的“时间依赖型”特点。Real-Time PCR分析表明，断头处理明显的抑制了家蚕不同发育时期PBANR基因的表达；体外JH类似物methoprene处理明显的抑制PBANR基因在家蚕-72h和-48h断头后的表达；交配处理也明显的抑制了不同发育时期PBANR基因的转录。2.交配对家蚕性信息素生物合成的影响运用数字基因表达谱（Digital Gene Expression，DGE）研究了交配对新羽化家蚕雌虫性信息素腺体内基因表达的影响。结果发现，交配后，性信息素生物合成相关基因的表达量显著下降；JH信号转导相关基因的表达量显著升高；免疫相关基因的表达量也显著升高。我们随后集中研究了交配过程中JH对家蚕性信息素生物合成的影响。GC/MS分析结果显示，在JH信号缺失的家蚕中，methoprene处理明显地抑制了性信息素的产量，同时过量表达JH也明显地抑制了性信息素的产量；对JH信号转导途径中的关键基因Met1和Met2在性信息素腺体中表达分析发现， Met1基因在新羽化家蚕性信息素腺体内的表达量是Met2基因的80多倍，说明Met1基因主要参与到家蚕性信息素腺体内JH信号的传导。进一步的RNAi介导的Met1基因的敲除试验发现，Met1基因的沉默导致了家蚕性信息素主要成分蚕蛾醇产量的显著下降。3.家蚕性信息素腺体胰腺脂肪酶类似基因的分子鉴定运用DGE技术对家蚕不同发育阶段（羽化前72h、羽化0h和羽化后72h）性信息素腺体内基因的表达水平进行测定，筛选出了7个性信息素腺体lipases基因。其中的一个lipase基因属于胰腺脂肪酶家族成员，我们将之命名为BmPLLG，并对该基因的分子特性进行了鉴定。序列分析表明，BmPLLG基因属于胰腺脂肪酶家族成员，其编码框核苷酸序列全长为1086bp，编码361个氨基酸残基，预测的蛋白分子量为40.3kDa，等电点为8.77，与其它昆虫的PLLG基因的氨基酸序列一致性较低，仅有16-49%；发育表达分析结果显示，该基因在家蚕不同发育时期性信息素腺体内的表达是时间依赖型的，随着时间的推移逐渐地升高；利用自制的抗体对BmPLLG蛋白在不同发育期的表达情况进行了分析，结果发现BmPLLG蛋白的表达模式与转录表达模式类似，均在性信息素合成关键时期开始大量表达。组织表达分析发现BmPLLG在性信息素腺体、头、表皮、卵、中肠、飞行肌和脂肪体内均有表达，但在卵中的表达量相对较低；RNAi介导的BmPLLG基因的沉默明显地抑制了蚕蛾醇产物的合成量，这些结果均表明该基因在蚕蛾醇生物合成过程中起着重要的作用。

全文目录


致谢  4-11
摘要  11-13
Abstract  13-16
第一部分 文献综述及引言  16-60
  第一章 文献综述  16-56
    1.1 鳞翅目昆虫性信息素的生物学研究  16-22
      1.1.1 鳞翅目昆虫性信息素的组成成分和化学结构  16-17
      1.1.2 鳞翅目昆虫性信息素的化学通讯系统  17-20
        1.1.2.1 释放系统  17-19
        1.1.2.2 传递系统  19
        1.1.2.3 接收系统  19-20
      1.1.3 鳞翅目昆虫性信息素的提取、鉴定和化学合成  20-21
        1.1.3.1 性信息素的提取  20
        1.1.3.2 化学结构的鉴定  20
        1.1.3.3 化学合成  20-21
      1.1.4 鳞翅目昆虫性信息素的生物合成  21-22
        1.1.4.1 鳞翅目昆虫性信息素生物合成的前体  21
        1.1.4.2 鳞翅目昆虫性信息素生物合成的一般途径  21-22
    1.2 鳞翅目昆虫性信息素生物合成的调控机制  22-25
      1.2.1 神经内分泌对鳞翅目昆虫性信息素生物合成的调控  22-24
      1.2.2 保幼激素和蜕皮激素对蛾子性信息素的调控作用  24-25
    1.3 PBAN 调控家蚕性信息素生物合成的分子机制  25-34
      1.3.1 PBAN 的相关研究  25-26
      1.3.2 PBAN 受体（PBANR）  26-28
      1.3.3 细胞外钙离子的作用  28-29
      1.3.4 储存的可操作性通道（SOCs）  29
      1.3.5 BmSTIM1 和 BmOrai1B  29-31
      1.3.6 钙调蛋白（CaM）  31
      1.3.7 钙调磷脂酶（calcineurin）  31-32
      1.3.8 家蚕和棉铃虫 PBAN 信号传导途径的区别  32-34
    1.4 家蚕性信息素合成与释放过程中的关键性基因  34-37
      1.4.1 脂肪酰基去饱和酶（Bmpgdesat1）  34-35
      1.4.2 性信息素腺体特异性的脂肪酰基还原酶（pgFAR）  35
      1.4.3 脂肪酸转运蛋白（BmFATP）  35-36
      1.4.4 酰基辅酶 A 结合蛋白（pgACBP 和 mgACBP）  36-37
    1.5 家蚕性信息素腺体 lipases 的研究  37-41
      1.5.1 性信息素腺体细胞质脂滴（LD）  37-38
      1.5.2 家蚕脂滴蛋白 1（BmLsd1）  38-39
      1.5.3 蚕蛾醇前体三酰甘油（TAGs）  39-40
      1.5.4 家蚕性信息素腺体 lipase 基因  40-41
    1.6 交配对家蚕性信息素生物合成影响的相关研究  41-56
      1.6.1 交配对昆虫生殖的影响  41-42
      1.6.2 昆虫性肽的相关研究  42-44
      1.6.3 保幼激素的研究  44-52
        1.6.3.1 保幼激素的生物学特性  44
        1.6.3.2 保幼激素的生物合成  44-46
        1.6.3.3 保幼激素的生物代谢  46
        1.6.3.4 保幼激素调控昆虫变态和生殖的作用  46-50
          1.6.3.4.1 幼虫蜕皮和变态的调控  46-49
          1.6.3.4.2 保幼激素在生殖成熟过程中的作用  49-50
        1.6.3.5 保幼激素的分子作用机制  50-52
      1.6.4 保幼激素候选受体 Met 基因的研究  52-53
      1.6.5 家蚕保幼激素的研究进展  53-56
  第二章 引言  56-60
    2.1 研究背景及意义  56-57
    2.2 主要研究内容  57-58
    2.3 技术路线  58-60
      2.3.1 家蚕性信息素腺体 PBANR 基因的分子鉴定  58
      2.3.2 交配对家蚕性信息素生物合成的影响  58-59
      2.3.3 家蚕性信息素腺体胰腺脂肪酶类似基因的分子鉴定  59-60
第二部分 家蚕性信息素生物合成相关基因的分子鉴定  60-116
  第三章 家蚕性信息素腺体 PBANR 基因的分子鉴定  60-72
    3.1 试验材料  61-62
      3.1.1 供试昆虫  61
      3.1.2 主要试剂  61
      3.1.3 仪器设备  61
      3.1.4 主要溶液的配制  61-62
    3.2 试验方法  62-65
      3.2.1 序列分析  62
      3.2.2 引物设计  62
      3.2.3 家蚕不同发育时期性信息素腺体总 RNA 的提取  62-63
      3.2.4 反转录  63-64
      3.2.5 Real-time PCR 检测  64
      3.2.6 断头试验  64
      3.2.7 体外 JH 类似物 methoprene 的处理  64-65
      3.2.8 交配处理实验  65
      3.2.9 统计分析  65
    3.3 结果与分析  65-70
      3.3.1 家蚕 PBANR 基因的序列分析  65-67
      3.3.2 家蚕 PBANR 基因的时间表达谱  67
      3.3.3 断头处理对家蚕 PBANR 基因转录水平的影响  67
      3.3.4 体外 JH 类似物 methoprene 的处理  67-68
      3.3.5 交配处理对家蚕 PBANR 基因的影响  68-70
    3.4 讨论  70-72
  第四章 交配对家蚕性信息素生物合成的影响  72-88
    4.1 材料与方法  73-74
      4.1.1 试验昆虫  73
      4.1.2 主要试剂  73-74
      4.1.3 仪器设备  74
      4.1.4 主要溶液的配制  74
    4.2 试验方法  74-81
      4.2.1 数字基因表达谱的工作流程  74-76
        4.2.1.1 试验流程  74
        4.2.1.2 标准化信息分析流程  74-76
      4.2.2 JH 类似物 methoprene 的体内处理  76
      4.2.3 样品的准备和 RNA 的提取  76
      4.2.4 反转录  76
      4.2.5 荧光定量 PCR 分析  76-77
      4.2.6 PCR 反应  77-78
      4.2.7 PCR 产物的纯化  78
      4.2.8 体外转录合成 dsRNA  78-80
      4.2.9 dsRNA 的注射和体内蚕蛾醇的分析  80
      4.2.10 统计分析  80-81
    4.3 结果  81-85
      4.3.1 DGE 结果中差异表达基因的统计  81
      4.3.2 DGE 结果中具体的差异表达基因  81-82
      4.3.3 JH 缺失后体内 methoprene 处理的结果  82
      4.3.4 JH 过量表达的结果  82-83
      4.3.5 家蚕羽化当天性信息素腺体内 Met1 和 Met2 基因的表达量  83
      4.3.6 Met1 的干涉效果  83-84
      4.3.7 RNAi 介导的 Met1 基因敲除效应对蚕蛾醇合成的影响  84-85
    4.4 讨论  85-88
  第五章 家蚕性信息素腺体胰腺脂肪酶类似基因的分子鉴定  88-116
    5.1 试验材料  88-92
      5.1.1 供试昆虫  88
      5.1.2 菌种及质粒  88-89
      5.1.3 主要试剂  89
      5.1.4 仪器设备  89
      5.1.5 所需溶液  89
      5.1.6 培养基  89-90
      5.1.7 SDS-PAGE 主要试剂  90-91
      5.1.8 Western blot 主要试剂  91-92
    5.2 试验方法  92-102
      5.2.1 生物信息学分析  92
      5.2.2 引物设计  92-93
        5.2.2.1 BmPLLG 基因 RNAi 试验的引物设计  92
        5.2.2.2 BmPLLG 基因荧光定量分析的引物设计  92-93
        5.2.2.3 BmPLLG 基因原核表达的引物设计  93
      5.2.3 RNA 提取与 cDNA 合成  93-94
        5.2.3.1 不同发育时期和不同组织 RNA 的提取  93-94
        5.2.3.2 检测干涉效果所用 RNA 的提取  94
      5.2.4 PCR 反应的检测和纯化  94
      5.2.5 PCR 产物的纯化  94-95
      5.2.6 荧光定量 PCR  95
      5.2.7 感受态细胞的制备（CaCl2 法）  95
      5.2.8 克隆载体与 PCR 纯化产物的连接  95-96
      5.2.9 连接载体的转化  96
      5.2.10 质粒 DNA 提取  96-97
      5.2.11 阳性克隆的筛选  97
      5.2.12 基因克隆与表达载体构建  97-98
      5.2.13 重组表达载体的转化与鉴定  98
      5.2.14 融合蛋白诱导表达条件的优化  98-99
      5.2.15 融合蛋白可溶性检测  99
      5.2.16 原核表达产物的 SDS-PAGE 检测  99-100
      5.2.17 原核表达与多克隆抗体的制备  100
      5.2.18 不同发育时期的 Western blot 检测  100
      5.2.19 体外转录合成 dsRNA  100-102
      5.2.20 dsRNA 的注射和体内蚕蛾醇的分析  102
      5.2.21 统计分析  102
    5.3 结果与分析  102-113
      5.3.1 生物信息学分析  102-108
        5.3.1.1 理化性质  102-103
        5.3.1.2 氨基酸序列多重联配和系统进化树分析  103-106
        5.3.1.3 疏水性分析  106-107
        5.3.1.4 跨膜分析  107
        5.3.1.5 蛋白质的二级结构预测  107-108
        5.3.1.6 蛋白定位的预测  108
      5.3.2 不同发育时期的表达  108
      5.3.3 不同组织的表达  108-109
      5.3.4 PCR 扩增和重组质粒载体的构建  109-110
      5.3.5 诱导表达条件的优化  110
      5.3.6 融合蛋白的可溶性检测  110-111
      5.3.7 融合蛋白的 Western blot 鉴定  111-112
      5.3.8 不同发育时期的 Western blot 检测  112
      5.3.9 RNAi 效果及其对蚕蛾醇产物的影响  112-113
    5.4 讨论  113-116
参考文献  116-136
在读期间论文发表情况  136-137
个人简历及硕士期间所获奖励情况  137

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 蚕桑 > 蚕基础科学 > 蚕的生理、遗传、生态、生物物理、生物化学 > 蚕遗传学
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