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长角血蜱Tm蛋白和MALC蛋白的免疫保护性初步分析

作　者: 田美媛
导　师: 曾巧英
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医
关键词: 长角血蜱肌球蛋白碱性轻链原肌球蛋白免疫保护性 RNAi
分类号: S852.746
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

蜱（Tick）传播疾病病原能力世界第二，是最重要的人畜共患病传播媒介之，特别是森林脑炎、新疆出血热、莱姆病、Q热等人畜共患病，严重威胁着世界人类健康和畜牧业的发展。因此，蜱的安全、无污染、有效防治成为畜牧业生产中急待解决的问题，因此研发新的防控制剂成为必然趋势。目前以免疫学为基础的疫苗防控逐渐成为最有前景的防治蜱方法之，而这防治途径的关键在于蜱功能基因的鉴定。本研究对免疫学方法筛选文库得到的长角血蜱（Haemaphysalislongicornis）原肌球蛋白（HL-Tm）和肌球蛋白碱性轻链（HL-MALC）两个功能基因进行生物信息学分析，随后进行克隆和原核表达，分别采用SDS-PAGE和Western-blot分析目的蛋白的表达情况和反应原性。采用实时定量PCR技术分析其在长角血蜱п同发育阶段及п同组织中的分布，以及通过动物免疫及攻蜱试验和RNAi试验来评估其作为控蜱免疫疫苗候选抗原的可行性。为深入探索蜱生理功能调控机制、评估新型环境友好害虫防控制剂和抗蜱疫苗候选抗原奠定基础，补充我国在防控蜱新制剂研究和蜱生理行为干预方面的空白。本论文研究结果如н：将HL-MALC基因和HL-Tm基因分别克隆到表达载体pGEX-4T-1中，选用大肠杆菌BL21(DE3)pLysE作为表达菌株进行原核表达，结果显示2个基因均表达。用Western-blot方法检测这些重组蛋白的反应原性，Western-blot结果显示兔抗长角血蜱饥饿成蜱阳性血清уrHL-MALC-GST蛋白和rHL-Tm-GST蛋白具有很强的反应条带。Real-timePCR分析HL-MALC基因和HL-Tm基因在长角血蜱п同发育阶段和组织的转录，结果显示HL-MALC基因和HL-Tm在长角血蜱п同发育阶段均表达，щ在成蜱时期表达量明显т调，щ在肌肉层中的表达水平明显高于足、鄂体等其他组织，因为蜱的肌肉层主要粘附于其表皮内侧。动物免疫及攻蜱试验结果表明rHL-MALC基因和rHL-Tm基因授予实验兔子部分抗蜱免疫保护效应。RNAi试验结果表明，HL-MALC基因和HL-Tm基因对节肢动物的吸血、血液消化，爬行，生长繁殖等生理行为可能起到重要的调控作用。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-6
英文缩略表  6-10
第一章文献综述  10-19
  1.1 蜱的概况  10-11
    1.1.1 蜱虫形态特征  10-11
    1.1.2 生长发育  11
  1.2 传播疾病  11-12
    1.2.1 森林脑炎  11-12
    1.2.2 新疆出血热  12
    1.2.3 莱姆病  12
    1.2.4 Q 热  12
  1.3 蜱肌肉的组成  12-14
    1.3.1 肌球蛋白  12-13
      1.3.1.1 肌球蛋白性质  13
      1.3.1.2 肌球蛋白功能  13
    1.3.2 原肌球蛋白  13
    1.3.3 肌动蛋白  13-14
    1.3.4 肌钙蛋白  14
  1.4 蜱类肌肉相关蛋白的研究进展  14-16
    1.4.1 长角血蜱的肌肉相关蛋白研究进展  14-15
    1.4.2 青海血蜱的肌肉相关蛋白研究进展  15
    1.4.3 扇头蜱肌肉相关蛋白的研究进展  15-16
  1.5 其他节肢动物肌肉相关蛋白的研究进展  16-17
    1.5.1 甲壳纲肌肉相关蛋白的研究进展  16
    1.5.2 蛛形纲肌肉相关蛋白的研究进展  16-17
    1.5.3 多足纲肌肉相关蛋白的研究进展  17
    1.5.4 昆虫纲肌肉相关蛋白的研究进展  17
  1.6 本研究的目的及意义  17-19
第二章 HL-Tm 和 HL-MALC 基因的生物信息学分析  19-30
  2.1 材料方法  19-20
    2.1.1 生物信息学方法分析目的基因的全序列  19-20
  2.2 结果  20-28
    2.2.1 HL-Tm 基因全长的获得及生物信息学分析  20-24
    2.2.2 HL-MALC 基因全长的获得及生物信息学分析  24-28
  2.3 讨论  28-30
第三章 HL-Tm 和 HL-MALC 基因的原核表达及其反应原性初步鉴定  30-40
  3.1 材料  31-32
    3.1.1 蜱、实验动物  31
    3.1.2 试剂  31
    3.1.3 仪器设备  31-32
  3.2 方法  32-35
    3.2.1 引物设计  32
    3.2.2 聚合酶链式反应  32
    3.2.3 HL-Tm 和 HL-MALC 基因的克隆以及测序  32-33
    3.2.4 重组表达载体的构建和 PCR 鉴定  33-34
    3.2.5 重组载体的原核表达  34
    3.2.6 MagneGSTTM 小量纯化蛋白  34
    3.2.7 Westernblot 检测  34-35
  3.3 结果  35-39
    3.3.1 长角血蜱基因 Tm 和 MALC 基因的 ORF 扩增结果  35-36
    3.3.2 HL-Tm 和 HL-MALC 基因表达产物及纯化的重组蛋白质的 SDS-PAGE 分析  36-37
    3.3.3 Western-blotting 分析表达产物  37-39
  3.4 讨论  39-40
第四章 HL-Tm 基因和 HL-MALC 基因在长角血蜱不同发育阶段和组织的转录  40-47
  4.1 材料  40-41
    4.1.1 蜱、组织收集、总 RNA 的提取和 cDNA 合成  40
    4.1.2 试剂  40-41
    4.1.3 仪器设备  41
  4.2 HL-Tm 基因和 HL-MALC 基因在长角血蜱不同发育阶段和组织的转录  41-42
    4.2.1 荧光相对定量 PCR 引物  41
    4.2.2 相对定量分析目的基因在长角血蜱п同发育阶段和组织中的转录  41-42
  4.3 结果  42-45
    4.3.1 相对定量分析 HL-Tm 基因在п同组织、п同发育阶段的转录  42-44
    4.3.2 相对定量分析 HL-MALC 基因在п同组织、п同发育阶段的转录  44-45
  4.4 讨论  45-47
第五章 HL-Tm 和 HL-MALC 基因的动物免疫及攻蜱实验和 RNAi 实验  47-60
  5.1 材料  47-48
    5.1.1 蜱、组织收集、总 RNA 的提取和 cDNA 合成  47
    5.1.2 试剂  47-48
    5.1.3 仪器设备  48
  5.2 方法  48-52
    5.2.1 融合蛋白的大量纯化  48-49
    5.2.2 蛋白免疫及攻蜱试验  49
    5.2.3 RNAi 实验  49-52
      5.2.3.1 Liner DNA template 的扩增  49-50
      5.2.3.2 ds RNA 的制备  50-51
      5.2.3.3 ds RNA 的显微注射  51-52
      5.2.3.4 接种至兔体饲血  52
      5.2.3.5 干扰效果分析  52
      5.2.3.6 干扰后蜱的沉默效果  52
  5.3 结果  52-58
    5.3.1 rHL-Tm 免疫和攻蜱实验  52-53
    5.3.2 rHL- MALC 免疫和攻蜱实验  53-54
    5.3.3 RNAi 试验结果  54-58
      5.3.3.1 dsRNA 的合成  54-55
      5.3.3.2 RNA 干扰后目的基因的沉默效果评价  55-56
      5.3.3.3 HL-Tm 沉默后对长角血蜱生物学特性的影响  56-57
      5.3.3.4 HL-MALC 沉默后对长角血蜱生物学特性的影响  57-58
  5.4 讨论  58-60
全文结论  60-61
参考文献  61-66
致谢  66-67
作者简历  67-68
附录  68-72

长角血蜱Tm蛋白和MALC蛋白的免疫保护性初步分析

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