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大果水晶梨及其褐色果皮突变体pal基因克隆及表达分析

作　者: 李义红
导　师: 于凤鸣
学　校: 河北科技师范学院
专　业: 果树学
关键词: 基因克隆 苯丙氨酸解氨酶 大果水晶梨 基因表达
分类号: S661.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


大果水晶梨褐色果皮突变体与大果水晶梨原品种相比，在果皮表面有一层木栓层。木栓层中的木质素是苯丙烷类代谢途径产生的酚类化合物的聚合物。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷代谢过程中的第一个关键酶。因此，研究pal基因对于探索大果水晶梨褐色果皮突变体的形成具有重要意义。以大果水晶梨及其褐色果皮突变体的叶片为材料提取DNA，分别以原品种和突变体的DNA为模板克隆pal。分别在幼果期（果点、果皮均未变褐）、果点变褐期、果皮变褐期和采收期采取果实样品，测定果皮PAL的活性、蛋白质含量、比活力及其pal的基因表达。结果如下：在果实幼果期、果点变褐期和果皮变褐期突变体果皮中的PAL活性和蛋白含量略高于原品种。在果点变褐期和果皮变褐期，大果水晶梨突变体果皮的PAL比活力均高于原品种。分别以大果水晶梨及其褐色果皮突变体叶片的DNA为模板，使用引物Ⅰ克隆得到大果水晶梨及其突变体的pal1的基因片段，序列分析表明两者没有差异。以3对简并引物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别克隆得到大果水晶梨及其褐色果皮突变体的pal2基因的片段。利用DNAMAN软件对序列进行拼接，得到2414bp的大果水晶梨pal2序列，其中外显子1997bp，内含子417bp；翻译得到的氨基酸序列由665个氨基酸组成。得到2411bp的大果水晶梨突变体的pal2序列，其中外显子2001bp，内含子410bp；翻译得到的氨基酸序列包含666个氨基酸。大果水晶梨pal2的内含子长于突变体的7bp。大果水晶梨及其褐色果皮突变体在不同时期的pal表达结果显示，大果水晶梨pal1的表达量在各个时期均高于突变体，表明pal1与果皮变褐呈负相关的趋势。而大果水晶梨pal2的表达量在果点变褐期、果皮变褐期、采收期均低于突变体，表明pal2与果皮变褐呈正相关的趋势。根据序列分析和定量表达的结果，推测大果水晶梨突变体pal2的内含子由于碱基的突变或内含子长度变短，导致调控元件的积极响应，是引起PAL的表达增强，使得木质素含量增加，导致褐色果皮形成的原因之一。

全文目录


缩略词  4-5
摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
第一章 绪论  10-18
  1.1 苯丙氨酸解氨酶研究现状  10-15
    1.1.1 苯丙氨酸解氨酶的存在与分布  10
    1.1.2 苯丙氨酸解氨酶的基本性质  10-11
    1.1.3 PAL 的酶学性质  11
    1.1.4 PAL 的催化机制  11
    1.1.5 pal 基因的结构特点与表达调控  11-12
    1.1.6 PAL 与木质素、木栓层及褐色果皮形成的关系  12-13
    1.1.7 苯丙烷类代谢途径的调控  13-14
    1.1.8 PAL 的其他生理作用  14-15
  1.2 果树 PAL 的研究现状  15-16
  1.3 本研究的目的和意义  16-18
    1.3.1 大果水晶梨及其褐色果皮突变体的研究现状  16-17
    1.3.2 本研究的目的与意义  17-18
第二章 材料与方法  18-26
  2.1 试验材料  18
  2.2 试剂与药品  18
  2.3 主要仪器设备  18
  2.4 试验方法  18-26
    2.4.1 苯丙氨酸解氨酶的提取及活性测定  18-19
    2.4.2 蛋白质含量测定  19-20
    2.4.3 苯丙氨酸解氨酶的比活力  20
    2.4.4 叶片 DNA 的提取  20-21
    2.4.5 大果水晶梨 pal 的克隆  21-23
    2.4.6 果皮 RNA 的提取  23
    2.4.7 反转录反应  23-24
    2.4.8 荧光定量 PCR 反应  24-26
第三章 结果与分析  26-48
  3.1 大果水晶梨及其突变体果皮颜色变化与部分生理生化指标分析  26-28
    3.1.1 不同时期果皮颜色变化  26-27
    3.1.2 苯丙氨酸解氨酶的活性、蛋白含量和比活力分析  27-28
  3.2 总 DNA 的提取及 pal 基因克隆  28-45
    3.2.1 大果水晶梨及其突变体叶片 DNA 的提取  28-29
    3.2.2 pal1 基因的克隆及生物信息学分析  29-32
    3.2.3 pal2 的克隆及生物信息学分析  32-45
  3.3 PAL 的同源性比较与进化分析  45-46
  3.4 总 RNA 的提取及 pal 基因的表达分析  46-48
    3.4.1 大果水晶梨及其突变体果皮总 RNA 的提取  46
    3.4.2 pal 基因的表达分析  46-48
第四章 讨论与结论  48-51
  4.1 讨论  48-50
    4.1.1 自然突变是果树选择育种的基础  48
    4.1.2 PAL 与大果水晶梨褐色果皮形成的关系  48-49
    4.1.3 大果水晶梨褐色果皮突变体形成原因分析  49-50
  4.2 结论  50-51
参考文献  51-57
发表论文和参加科研情况说明  57-58
附录  58-66
致谢  66

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 仁果类 > 梨
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