学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

干旱和复水条件下甘蔗特异基因诱导表达及其克隆的研究

作　者: 吴凯朝
导　师: 杨丽涛
学　校: 广西大学
专　业: 作物栽培学与耕作学
关键词: 甘蔗 干旱 复水 cDNA-AFLP cDNA-SCoT 基因克隆
分类号: S566.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 126次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


干旱是制约我国甘蔗生产的主要影响因子。选育抗旱能力强、地域适应性广的高产高糖新品种是解决季节性干旱给我国甘蔗生产带来不利影响的有效途径。挖掘抗旱力强、水分高效利用的基因并通过遗传转化进行分子育种是提高甘蔗抗旱能力研究的新方向。抗旱甘蔗品种既应具有在干旱胁迫状态下的耐受能力,还应具有干旱胁迫状态解除后恢复快速生长的能力,因此研究甘蔗对干旱和干旱后复水的生理和分子响应机理对如何提高甘蔗抗旱能力的遗传改良都具有同样重要的意义。甘蔗是高光效C4作物,具有耐旱、耐涝、耐瘠、抗病、高生物量等特性,是作物重要耐旱基因资源。为了研究甘蔗响应水分胁迫的生理和分子机理,挖掘甘蔗的耐早、水分高效利用及促进生长的基因,本研究选用优良抗旱育种杂交亲本GT11为试验材料,在渗透调节、保护酶活性、物质代谢和内源激素等几个方面探讨甘蔗伸长期在干旱及干旱后复水状态下生理响应；利用cDNA-AFLP和cDNA-SCoT两种基因差异分析方法分离和筛选甘蔗在干旱及干旱后复水诱导的差异表达基因,并对获得的部分特异基因片段进行克隆获得基因全长cDNA,为作物抗旱性的遗传改良提供相应的基因资源。主要研究内容和结果如下：1.在干旱胁迫下,甘蔗品种GT11伸长期在渗透调节、保护酶系统、物质代谢和内源激素等几个方面都做出积极的生理响应,表明了GT11在水分胁迫下可能有较强的适应能力。(1)干旱胁迫下,甘蔗的渗透调节物质可溶性糖和脯氨酸大量增加,P5CS活力增强,而可溶性蛋白质含量下降,ProDH活力受到限制。复水处理后,叶片中可溶性糖含量急剧下降后回调；脯氨酸含量很快下降；可溶性蛋白质含量快速回升；P5CS活力很快下降；ProDH活力急剧上升。(2)干旱胁迫下,甘蔗的丙二醛含量和超氧阴离子含量升高,保护系统酶POD、 CAT、SOD和GSH-R活力都在不同程度提高。复水处理后,丙二醛含量和超氧阴离子含量很快下降,保护系统酶SOD和GSH-R活力降低,CAT活性表现为先下降后升高。与对照相比,保护系统酶活力在复水前期保持较高活力水平。(3)干旱胁迫下,甘蔗的ABA含量随受干旱胁迫进程不断加大累积,PAO活力上升。复水处理后,ABA含量先上升后下降,PAO活力很快降低。2.使用cDNA-AFLP差异显示方法分离得到406个与水分胁迫相关TDFs,167个TDFs反向Northern印迹杂交验证为阳性。通过对27个TDFs进行克隆、测序、比对分析,涉及新陈代谢、能量代谢、转录调控、结合功能蛋白、环境互作等相关功能基因。3.使用cDNA-SCoT差异显示方法分离得到316个与水分胁迫相关TDFs,180个TDFs反向Northern印迹杂交验证为阳性。对177个TDFs进行克隆、测序、比对分析,其中107个TDFs在NCBI数据库有较高相似度已知功能基因,28个TDFs在NCBI数据库有相似性很高的未知功能基因和假想蛋白。135个TDFs可以分为14类：新陈代谢、能量代谢、运输途径、通信及信号转导、细胞循环及DNA加工、转录调控因子、蛋白质合成、蛋白质加工、结合功能蛋白、转座子、毒性及质粒蛋白、细胞分生物合成、防御和未分类蛋白。4.利用半定量RT-PCR对12个从cDNA-SCoT分离获得的TDFs进行表达验证分析,全部12个基因表达量都在一定程度上受到干旱诱导或干旱后复水的诱导。其中4个基因受到干旱胁迫诱导上调表达,为抗旱类基因；7个基因受复水诱导上调表达,为恢复生长调节类基因；1个基因在干旱和复水都被诱导上调表达,为双重功能基因。从12个基因的表达模式分类结果和该基因的生物学信息功能分析结果基本是一致的。5.以GT11的cDNA第一链为模板,采用同源克隆方法成功克隆到5个水分胁迫相关基因全长cDNA,分别为Sc-atpI基因、Sc-SUTl基因、Sc-SAMDC3基因、Sc-Tuba3基因和Sc-HSP70基因,并对这些基因的核苷酸序列及其编码氨基酸序列进行分析,结果表明5个基因在NCBI数据都有同源性很高的禾本科作物(玉米、高粱)基因。Sc-atpI基因、Sc-Tuba3基因、Sc-HSP70基因、Sc-SAMDC3基因为首次在甘蔗中克隆得到。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-18
第1章 前言  18-35
  1.1 植物抗旱分子机理研究进展  18-24
    1.1.1 渗透调节  18-21
      1.1.1.1 脯氨酸  19
      1.1.1.2 海藻糖  19-20
      1.1.1.3 甜菜碱  20-21
    1.1.2 Lea蛋白、AQP和DHNs  21-22
      1.1.2.1 Lea蛋白  21
      1.1.2.2 AQP  21
      1.1.2.3 DHNs  21-22
    1.1.3 受ABA等内源激素调节基因  22-24
  1.2 植物复水机制研究进展  24-26
  1.3 基因差异表达研究方法技术原理及其应用  26-29
    1.3.1 cDNA-AFLP差异显示分析技术原理、特点及其研究进展  26-28
    1.3.2 cDNA-SCoT差异显示分析技术原理、特点及其研究进展  28-29
  1.4 甘蔗抗旱分子机理研究进展  29-33
  1.5 本研究的立项依据及意义  33-35
第2章 甘蔗伸长期对水分胁迫的生理响应  35-51
  2.1 试验材料与方法  35-41
    2.1.1 供试材料和材料种植  35-36
    2.1.2 试验处理  36
    2.1.3 试验测定的指标和方法  36-40
      2.1.3.1 土壤相对含水量测定  36
      2.1.3.2 脯氨酸(Pro)含量测定  36
      2.1.3.3 △~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)活性测定测定  36-37
      2.1.3.4 脯氨酸脱氢酶(ProDH)活性测定  37
      2.1.3.5 过氧化物酶(POD)活性测定  37
      2.1.3.6 过氧化氢酶(CAT)活性测定  37-38
      2.1.3.7 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定  38
      2.1.3.8 超氧阴离子(O_2~-)含量测定  38
      2.1.3.9 脱落酸(ABA)含量测定  38-39
      2.1.3.10 丙二醛(MDA)含量测定  39
      2.1.3.11 谷胱甘肽还原酶(GSH-R)活性测定  39
      2.1.3.12 可溶性糖含量测定  39-40
      2.1.3.13 可溶性蛋白质含量测定  40
      2.1.3.14 多胺氧化酶(PAO)活性测定  40
    2.1.4 数据处理  40-41
  2.2 结果与分析  41-49
    2.2.1 土壤相对含水量  41
    2.2.2 甘蔗叶片MDA含量变化  41-42
    2.2.3 甘蔗叶片可溶性糖含量变化  42-43
    2.2.4 甘蔗叶片可溶性蛋白质含量变化  43
    2.2.5 甘蔗叶片O_2~-含量变化  43-44
    2.2.6 甘蔗叶片POD活性变化  44-45
    2.2.7 甘蔗叶片CAT活性变化  45
    2.2.8 甘蔗叶片SOD活性变化  45-46
    2.2.9 甘蔗叶片GSH-R活性变化  46
    2.2.10 甘蔗叶片脯氨酸含量变化  46-47
    2.2.11 甘蔗叶片P5CS活性变化  47
    2.2.12 甘蔗叶片ProDH活性变化  47-48
    2.2.13 甘蔗叶片ABA含量变化  48-49
    2.2.14 甘蔗叶片PAO活性变化  49
  2.3 小结  49-51
    2.3.1 渗透调节物质  50
    2.3.2 膜损伤及保护系统  50
    2.3.3 内源激素及相关酶  50-51
第3章 甘蔗伸长期水分胁迫诱导相关基因差异表达分析  51-101
  3.1 甘蔗干旱和干旱后复水基因cDNA-AFLP差异显示分析  52-70
    3.1.1 材料种植和处理  52
    3.1.2 方法  52-61
      3.1.2.1 总RNA的提取  52-53
      3.1.2.2 cDNA第一链合成  53
      3.1.2.3 cDNA第二链的合成  53
      3.1.2.4 双链cDNA纯化  53
      3.1.2.5 双链cDNA酶切反应  53-54
      3.1.2.6 接头退火及连接  54-55
      3.1.2.7 预扩增  55
      3.1.2.8 选择性扩增  55-56
      3.1.2.9 选择性扩增产物电泳检测  56-57
      3.1.2.10 差异片段的回收、再扩增、再回收  57-58
      3.1.2.11 反向Northern印迹杂交验证  58-59
      3.1.2.12 差异片段克隆  59
      3.1.2.13 质粒抽提  59-60
      3.1.2.14 测序  60
      3.1.2.15 序列比较及基因功能分析  60-61
    3.1.3 cDNA-AFLP分离水分胁迫诱导表达基因结果与分析  61-70
      3.1.3.1 总RNA提取和第一链cDNA合成  61
      3.1.3.2 甘蔗叶片干旱和复水诱导基因表达分谱分析  61-62
      3.1.3.3 差异片段回收及反向Northern印迹杂交验证  62-64
      3.1.3.4 部分验证为阳性TDFs的克隆及核苷酸序列分析  64-67
      3.1.3.5 受干旱和干旱后复水诱导表达基因功能分析和功能类群  67-70
  3.2 甘蔗干旱和干旱后复水基因cDNA-SCoT差异显示分析  70-100
    3.2.1 材料种植和处理  70
    3.2.2 方法  70-74
      3.2.2.1 总RNA的提取  70
      3.2.2.2 cDNA第一链合成  70
      3.2.2.3 SCoT引物设计及SCoT-PCR扩增反应体系、反应程序  70-72
      3.2.2.4 电泳检测  72-73
      3.2.2.5 差异片段的回收、再扩增、再回收  73
      3.2.2.6 反向Northern印迹杂交验证  73
      3.2.2.7 差异片段克隆  73
      3.2.2.8 质粒抽提  73
      3.2.2.9 测序  73
      3.2.2.10 序列比较及基因功能分析  73-74
    3.2.3 cDNA-SCoT分离水分胁迫诱导表达基因结果与分析  74-100
      3.2.3.1 总RNA提取和cDNA第一链合成  74
      3.2.3.2 甘蔗叶片水分胁迫下基因差异表达谱分析  74-75
      3.2.3.3 差异片段回收及反向Northern印迹杂交验证  75-76
      3.2.3.4 部分验证为阳性差异片段的克隆、核苷酸序列分析和基因功能推测分析  76-97
      3.2.3.5 受干旱和干旱后复水诱导表达基因功能类群  97-100
  3.3 小结  100-101
    3.3.1 cDNA-AFLP差异显示表达分析  100
    3.3.2 cDNA-SCoT差异显示表达分析  100-101
第4章 水分胁迫诱导基因片段的半定量RT-PCR表达分析  101-109
  4.1 材料和方法  102-105
    4.1.1 材料种植和处理  102
    4.1.2 方法  102-105
      4.1.2.1 总RNA提取  102
      4.1.2.2 cDNA第一链合成  102
      4.1.2.3 半定量RT-PCR  102-105
  4.2 结果与分析  105-108
  4.3 小结  108-109
第5章 甘蔗水分胁迫诱导表达基因全长CDNA克隆与结构分析  109-145
  5.1 材料和方法  109-111
    5.1.1 材料种植  109
    5.1.2 甘蔗叶片总RNA提取  109
    5.1.3 甘蔗cDNA第一链的合成  109
    5.1.4 引物设计、合成  109-110
    5.1.5 目的基因片段回收纯化  110
    5.1.6 目的基因克隆  110
    5.1.7 质粒抽提  110
    5.1.8 测序  110
    5.1.9 基因序列的生物学信息分析软件及网站  110-111
  5.2 结果与分析  111-144
    5.2.1 总RNA提取及cDNA第一链合成  111-112
    5.2.2 甘蔗Sc-atpI基因克隆及其序列分析  112-118
      5.2.2.1 甘蔗Sc-atpI基因的RT-PCR扩增  112-113
      5.2.2.2 甘蔗Sc-atpI基因核苷酸序列分析  113-114
      5.2.2.3 甘蔗Sc-atpI基因编码的氨基酸序列结构分析  114-117
      5.2.2.4 甘蔗Sc-atpI基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析  117-118
    5.2.3 甘蔗Sc-SUT1基因克隆及其序列分析  118-124
      5.2.3.1 甘蔗Sc-SUT1基因的RT-PCR扩增  118
      5.2.3.2 甘蔗Sc-SUT1基因核苷酸序列分析  118
      5.2.3.3 甘蔗Sc-SUT1基因编码氨基酸序列保守区分析  118-120
      5.2.3.4 甘蔗Sc-SUT1基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析  120-124
    5.2.4 甘蔗Sc-SAMDC3基因克隆及其序列分析  124-132
      5.2.4.1 甘蔗Sc-SAMDC3基因的RT-PCR扩增  124-125
      5.2.4.2 甘蔗Sc-SAMDC3基因核苷酸序列分析  125-126
      5.2.4.3 甘蔗Sc-SAMDC3基因编码氨基酸序列保守区分析  126-127
      5.2.4.4 甘蔗Sc-SAMDC3基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析  127-132
    5.2.5 甘蔗Sc-Tuba3基因克隆及其序列分析  132-138
      5.2.5.1 甘蔗Sc-Tuba3基因RT-PCR扩增  132-133
      5.2.5.2 甘蔗Sc-Tuba3基因核苷酸序列分析  133-134
      5.2.5.3 甘蔗Sc-Tuba3基因编码氨基酸序列保守区分析  134-136
      5.2.5.4 甘蔗Sc-Tuba3基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析  136-138
    5.2.6 甘蔗Sc-HSP70基因克隆及其序列分析  138-144
      5.2.6.1 甘蔗Sc-HSP70基因RT-PCR扩增  138-139
      5.2.6.2 甘蔗Sc-HSP70基因核苷酸序列分析  139-140
      5.2.6.3 甘蔗Sc-HSP70基因编码氨基酸序列保守区分析  140-144
      5.2.6.4 甘蔗Sc-HSP70基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析  144
  5.3 小结  144-145
第6章 讨论与结论  145-156
  6.1 全文讨论  145-154
    6.1.1 GT11对水分胁迫的生理响应机制  145-147
      6.1.1.1 渗透调节物质  145-146
      6.1.1.2 膜损伤及保护系统  146
      6.1.1.3 内源激素及相关酶  146-147
    6.1.2 水分胁迫诱导基因差异表达分析  147-151
      6.1.2.1 cDNA-AFLP差异显示分析  147-148
      6.1.2.2 cDNA-SCoT差异显示分析  148
      6.1.2.3 两种差异表达方法比较  148-149
      6.1.2.4 两种基因差异显示方法结果比较  149
      6.1.2.5 甘蔗水分胁迫相关基因筛选和分离  149-151
    6.1.3 基因Semi-QRT-PCR表达分析  151-153
      6.1.3.1 抗旱类基因  151-152
      6.1.3.2 恢复生长调节类基因  152
      6.1.3.3 双重功能类基因  152
      6.1.3.4 基因定量表达方法  152-153
    6.1.4 基因克隆与结构分析  153-154
  6.2 全文结论  154-155
  6.3 论文创新点  155
  6.4 问题与展望  155-156
致谢  156-157
参考文献  157-175
附录  175

相似论文

  1. 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制,S666.4
  2. 干旱胁迫对桂花生长及生理生态的影响,S685.13
  3. 军曹鱼生长激素基因（GH）的克隆和表达,Q786
  4. Pseudomonas sp.RT-1低温脂肪酶发酵条件优化、纯化及基因的克隆表达,TQ925
  5. ABA和H2O2对干旱高温复合胁迫诱导的玉米sHSPs和抗氧化防护酶的作用,S513
  6. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  7. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
  8. 多菌灵降解菌的分离鉴定、生物学特性及多菌灵水解酶基因的克隆和表达研究,X172
  9. 氰氟草酯降解菌分离鉴定、降解特性的研究及氰氟草酯水解酶基因（chbH）的克隆和表达,X172
  10. 腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与表达,Q78
  11. 产酶溶杆菌OH11菌株胞外酶调控相关基因ctp的克隆及功能分析,TQ925
  12. α-半乳糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆、表达、纯化和性质研究,TQ925
  13. 大圳灌区干旱风险评价,S423
  14. 灌区干旱评价系统研究,S423
  15. 烟夜蛾气味受体基因和精氨酸激酶基因的克隆与表达分析,S433.4
  16. 花前干旱锻炼对花后干旱逆境下小麦产量和品质形成的影响及其生理机制,S512.1
  17. 大豆细胞质雄性不育系与保持系基因差异表达的cDNA-AFLP分析及atp6基因RNA编辑研究,S565.1
  18. 萝卜镉胁迫响应相关基因克隆及其表达分析,S631.1
  19. 逐渐干旱对牡丹实生苗生理指标的影响和牡丹GA20-氧化酶基因的克隆与序列分析,S685.11
  20. 多个猪IgGⅡB类Fc受体剪接异构体的分子生物学特征,S828
  21. 西部干旱地区农户旱地种植行为实证研究,S423

中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 糖料作物 > 甘蔗
© 2012 www.xueweilunwen.com