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嗜线虫致病杆菌HB310菌株几丁质酶基因的克隆及其可湿性粉剂的研制

作　者: 文旭
导　师: 王勤英
学　校: 河北农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 嗜线虫致病杆菌几丁质酶基因克隆可湿性粉剂
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310（Xn HB310）是与小卷蛾斯氏线虫（Steinernema carpocapsae）共生的细菌，属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae），革兰氏染色阴性。前期研究发现Xn HB310具有广谱的杀虫和抑菌活性，对其胞内总蛋白的质谱鉴定发现含有几丁质酶。本研究从Xn HB310中克隆了2个几丁质酶基因chi60和chi70，为进一步明确共生菌的致病和抑菌机理提供依据。另外对XnHB310可湿性粉剂配方进行了筛选，得到了50%Xn HB310可湿性粉剂配方。现将主要结果总结如下：1、对嗜线虫致病杆菌HB310抑菌活性的测定结果表明，Xn HB310发酵液和胞内蛋白对苹果轮纹病菌和苹果腐烂病菌菌丝生长均有抑制作用。质谱鉴定结果表明Xn HB310胞内蛋白含有几丁质酶，初步判断其抑菌活性可能与几丁质酶有关。2、根据质谱鉴定结果和已报道的X. nematophila ATCC19061菌株中几丁质酶基因设计了两对引物，以Xn HB310总DNA为模板，通过PCR扩增的方法分别克隆了两个编码几丁质酶的基因chi60和chi70，GenBank登陆号分别为：KC701470和KC701471。对其进一步序列分析显示，chi60全长基因含有1608个碱基，编码535个氨基酸组成的蛋白；chi70全长基因含有1947个碱基，编码648个氨基酸组成的蛋白。然后对chi60和chi70两个基因进行原核表达，IPTG进行诱导结果表明这两个基因没能在大肠杆菌中成功表达。3、运用生物信息学方法对两个几丁质酶进行了分析，获得CHI60蛋白理论分子量为59.3kDa，等电点为4.51，CHI60蛋白序列中不含信号肽，属于稳定的水溶性蛋白；CHI70蛋白理论分子量为72.4kDa，等电点为4.89，CHI70蛋白序列中也不含信号肽，同样属于稳定的水溶性蛋白。并且采用4种不同的预测方法分析了CHI60和CHI70蛋白的二级结构，通过同源建模构建了精确度较高的CHI60和CHI70蛋白的三级结构。对这两个蛋白进行了多序列比对，发现几丁质酶有一定的保守区域。最后构建了两个蛋白的系统进化树，显示出几丁质酶蛋白序列具有在细菌分类学和系统进化学应用的潜在应用价值。4、以Xn HB310细胞沉淀菌粉为原药，通过对载体、润湿剂、分散剂的筛选，获得了50%Xn HB310可湿性粉剂。其配方为：Xn HB310菌粉50%、分散剂木质素磺酸钠5%、润湿剂拉开粉5%、脱脂奶粉0.2%、载体白炭黑39.8%。50%Xn HB310可湿性粉剂检测结果表明各项指标均符合可湿性粉剂国家标准要求。田间药效实验表明，50%Xn HB310可湿性粉剂500倍稀释液喷药72h后，对2龄小菜蛾的死亡率达到82.9%，为Xn HB310可湿型粉剂的研究提供了依据。

嗜线虫致病杆菌HB310菌株几丁质酶基因的克隆及其可湿性粉剂的研制

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