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胡萝卜软腐果胶杆菌与黄花马蹄莲不同方式互作的蛋白比较分析及相应致病基因的研究

作　者: 杨钟灵
导　师: 范加勤
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 胡萝卜软腐果胶杆菌彩色马蹄莲互作蛋白质组分析鞭毛 flgk 致病因子
分类号: S436.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

彩色马蹄莲(Zantedeschia sp.)为天南星科多年生球根花卉,因其艳丽的色彩,高雅的姿态被予为21世纪的“花卉之星”。然而,在全球范围内,由于细菌性软腐病严重发生,且没有理想的防治方法,.极大的阻碍了彩色马蹄莲产业的发展。据报道,引起彩色马蹄莲软腐病发病严重的病原菌主要是胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,Pcc).Pcc通过产生各种植物细胞降解酶(PCWDEs),如果胶酶、纤维素酶、蛋白酶等致病因子,破坏寄主植物的防御系统并发生致病症状。Pcc能引起多种植物发生软腐病,给全世界的农业带来严重的经济损失。为了探索Pcc在与植物互作过程中的体内蛋白质差异及这些差异蛋白在致病过程中的作用。本研究以2YT培养基培养的Pcc、与黄花马蹄莲离体互作的Pcc、与黄花马蹄莲活体互作的Pcc为研究对象,并运用双向电泳技术、质谱技术及ImageMaster2D platinum5.0软件对这三种条件下的Pcc差异表达蛋白质进行比较分析。结果发现：(1)2YT培养基培养的Pcc和与黄花马蹄莲离体互作的Pcc有70个蛋白点存在表达差异,占总蛋白数的18.12%。其中,利用质谱分析对5个表达差异较大的蛋白进行分析发现：2个特异表达蛋白分子伴侣DnaK和1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)均为代谢类蛋白；3个显著上调表达蛋白中ATP合酶α亚基和半胱氨酸合酶为代谢类蛋白,而β-内酰胺酶为抗生素类蛋白,是Pcc的主要致病因子之一。(2)将活体互作的Pcc体内蛋白与2YT培养基培养的Pcc和离体互作的Pcc的体内蛋白分别进行比较,发现这三种方式诱导的体内差异蛋白中,离体互作和活体互作中蛋白表达存在的差异最大,上调表达蛋白点68个,上调率达17.09%,下调表达蛋白65个,下调率达16.33%。其中有53个差异蛋白利用质谱分析进行功能注释。为了验证这些差异蛋白在Pcc致病过程中的作用,本试验利用两亲交换方法对表达差异较大的蛋白点进行基因单交换突变,成功构建出17个单交换突变体,其中9个突变体没有致病力差异,8个突变体致病力降低或完全丧失,为△PrmA、△IclR、△ClpP、△FIgK、△PotA、△MreB.△HsP33和△Oadh2Al。为了进一步验证阐明鞭毛钩基因flgKpcc对Pcc的致病性等方面的影响。本研究用两亲同源交换法成功构建了基因缺失突变体△flgKpcc,与野生型菌株PccS1相比,△flgKpcc鞭毛缺失,菌体易沉降,在0.3%半固体培养基上运动能力明显降低；尽管生长速率无明显变化,但纤维素酶,蛋白酶活性和生物膜形成能力明显下降；对黄花马蹄莲的致病性明显减弱。基因互补可以使上述突变表型恢复。因此,鞭毛基因flgKpcc突变不仅影响了细菌的运动性,而且对病原菌毒性相关的因子也产生了影响,对病原菌引起寄主发病具有重要的作用。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
上篇文献综述  10-32
  第一章胡萝卜软腐果胶杆菌的毒性和致病机理研究  11-17
    1 胡萝卜软腐果胶杆菌的分类及危害  11-13
    2 胡萝卜软腐果胶杆菌的致病机理  13-17
      2.1 群体感应  13-14
      2.2 脂多糖  14-15
      2.3 碳青霉烯抗生素  15
      2.4 胞外水解酶类  15-16
      2.5 鞭毛  16-17
  第二章植物与细菌互作的蛋白质组学研究  17-29
    1 蛋白质组学  17-23
      1.1 蛋白质组学的含义  17-18
      1.2 蛋白质组学的研究内容  18-19
      1.3 蛋白质组学的主要研究技术  19-23
    2 植物与细菌互作的蛋白质组学研究  23-29
      2.1 蛋白质组学在寄主植物研究中的应用  24-26
      2.2 蛋白质组学在植物病原菌研究中的应用  26-29
  第三章细菌鞭毛的研究进展  29-32
    1 细菌鞭毛的结构  29-30
    2 细菌鞭毛的分类  30
    3 细菌鞭毛的运动机理  30-31
    4 细菌鞭毛的功能  31-32
下篇研究内容  32-73
  第一章与黄花马蹄莲互作过程中胡萝卜软腐果胶杆菌的差异表达蛋白分析  33-45
    摘要  33-34
    1 材料与方法  34-40
      1.1 供试菌株  34
      1.2 试验试剂和仪器  34
      1.3 试验方法  34-40
    2 结果与分析  40-43
      2.1 蛋白质差异表达谱分析  40-41
      2.2 差异蛋白点的质谱鉴定  41-43
    3 讨论  43-45
  第二章胡萝卜软腐果胶杆菌与黄花马蹄莲体内和体外互作过程中的蛋白表达差异分析  45-63
    摘要  45-46
    1 材料与方法  46-52
      1.1 供试菌株  46-47
      1.2 引物的设计与合成  47
      1.3 酶、抗生素、试剂盒和化学试剂  47-48
      1.4 试验方法  48-52
    2 结果与分析  52-60
      2.1 预实验  52
      2.2 蛋白差异分析  52-54
      2.3 差异蛋白点的质谱鉴定  54-56
      2.4 单突变体的致病分析  56-60
    3 讨论  60-63
  第三章胡萝卜果胶杆菌鞭毛钩基因FLGK的功能分析  63-73
    摘要  63-64
    1 材料与方法  64-67
      1.1 材料  64-65
      1.2 缺失突变体及其互补菌株的构建  65-67
      1.3 细菌生长、游动性、沉降性及生物膜的测定  67
      1.4 致病因子的测定  67
      1.5 细菌致病性的测定  67
    2 结果与分析  67-71
      2.1 突变菌株与互补菌株的构建  67-68
      2.2 运动性、生物膜及生长能力测定  68-69
      2.3 致病相关因子的比较  69-70
      2.4 ΔflgKpcc的致病性  70-71
    3 讨论  71-73
全文小结  73-75
参考文献  75-83
附录  83-87
致谢  87-89
攻读学位期间发表的学术论文  89

胡萝卜软腐果胶杆菌与黄花马蹄莲不同方式互作的蛋白比较分析及相应致病基因的研究

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