学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

病毒基因组连接蛋白影响烟草脉带花叶病毒致病性的机制

作　者: 牟安丽
导　师: 李向东
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: VPg 致病性马铃薯Y病毒属 eIF(iso)4E 互作
分类号: S435.72
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 17次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒的基因组连接蛋白（viral genome-linked protein，VPg）是一个多功能蛋白，通过与多个寄主因子及病毒蛋白互作参与病毒的复制，细胞间移动及长距离移动等过程。VPg共价结合于病毒基因组RNA的5′端，位于线状病毒粒子的末端。烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）属于马铃薯Y病毒属，近年来在我国烟草上的发生有上升和蔓延的趋势。本研究以携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的TVBMV cDNA侵染性克隆（pCamTVBMV-GFP）为载体，通过定点突变获得了TVBMV VPg的29个突变体，利用农杆菌共浸润的方法分析了这些突变对TVBMV致病性的影响，并通过酵母双杂交（YTHS）和双分子荧光互补（BiFC）技术分析了VPg及其突变体与eIF(iso)4E互作的情况。主要结果如下：VPg第42位和45位的赖氨酸（Lys）分别突变为丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）得到的6个突变体（K42A、K42E、K42Q、K45A、K45E、K45Q）和第178位丝氨酸（Ser）突变为Ala、Glu、Lys的3个突变体（S178A、S178E、S178K）在本氏烟上的致病力与野生型病毒的一致，但K42A和K45E在普通烟上病毒浓度比野生型病毒低得多。第54位的甘氨酸（Gly）突变为Ala、Glu、精氨酸（Arg）后（G54A、G54E、G54R）均导致病毒在本氏烟及普通烟上的致病力显著降低。VPg第10位的亮氨酸（Leu）、第40位和第64位的的酪氨酸（Tyr）分别突变为Ala、天冬氨酸（Asp）、Arg后（L10A、L10D、L10R、Y40A、Y40D、Y40R、Y64A、Y64D、Y64R）突变体丧失长距离移动的能力， Y40D、Y40R不能进行细胞间移动。VPg中与TVBMV基因组RNA相连的第64位Tyr突变为Ala、Asp、Arg后（Y64A、Y64D、Y64R）突变体丧失在浸润叶片中的复制能力，突变为带有苯环的苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）后（Y64F、Y64W）病毒依然不能复制，说明在第64位的酪氨酸对病毒复制是必需的。VPg第183位的Leu突变为Ala和Lys（L183A、L183K）会使病毒的致病力增强，124位的Leu突变为Ala（L124A）会使病毒的致病力减弱，而183位的Leu突变为Glu（L183E）、119位的Tyr突变为Ala（Y119A）以及119位和124位同时突变为Ala（Y119A-L124A）均导致病毒在本氏烟中不能复制。TVBMV VPg可以自身互作，而导致不能长距离移动的突变体的自身互作能力与野生型VPg相比下降。TVBMV VPg在酵母体内和植物体内均能够与eIF(iso)4E-2特异性地互作，但不能与eIF4E和eIF(iso)4E-1互作，影响病毒复制的突变体VPg均不能与eIF(iso)4E-2互作，说明VPg与eIF(iso)4E-2的互作是与病毒的复制相关的。以上结果表明，TVBMV VPg在病毒侵染和致病过程中有重要作用，VPg与eIF(iso)4E的互作是决定病毒侵染的重要步骤。本研究明确了马铃薯Y病毒属病毒VPg影响病毒致病性的机制，为TVBMV以及其他烟草病毒的防治提供物质基础和理论指导。

全文目录

缩略词表  5-10
中文摘要  10-12
Abstract  12-14
1 前言  14-27
  1.1 马铃薯 Y 病毒属病毒（potyviruses）基因组结构及蛋白功能  14-16
  1.2 马铃薯 Y 病毒属病毒 VPg 的功能  16-21
    1.2.1 VPg 的亚细胞定位  16-17
    1.2.2 VPg 参与病毒复制  17-18
    1.2.3 VPg 参与病毒翻译  18-19
    1.2.4 VPg 参与病毒移动  19-20
    1.2.5 VPg 的磷酸化作用  20-21
  1.3 植物 eIF4E 与病毒的互作  21-25
    1.3.1 eIF4E 在植物中的功能  21-22
    1.3.2 植物 e1F4E 在病毒侵染中的作用  22
    1.3.3 eIF4E 参与 potyviruses 侵染的作用机制  22-23
    1.3.4 Potyviruses 选择性地与 eIF4E 基因家族成员特异性互作  23-24
    1.3.5 eIF4E 在植物抗病上的应用  24-25
  1.4 本论文的研究目的  25-27
    1.4.1 烟草脉带花叶病毒的研究进展  25-26
    1.4.2 本论文的研究目的  26-27
2 材料与方法  27-42
  2.1 实验材料  27-28
    2.1.1 供试植物  27
    2.1.2 菌株和载体  27
    2.1.3 生化及分子生物学试剂  27
    2.1.4 主要实验仪器  27-28
  2.2 实验方法  28-42
    2.2.1 定点突变方法  28-31
    2.2.2 病毒接种方法  31-33
    2.2.3 注射叶片及系统侵染叶片的 RNA 检测  33-34
    2.2.4 利用 ELISA 测定病毒浓度  34-35
    2.2.5 实时荧光 PCR 测定病毒 RNA 积累水平  35-36
    2.2.6 突变体侵染烟草后细胞间移动情况分析  36
    2.2.7 蛋白互作的 YTHS 和 BiFC 分析  36-42
3 结果与分析  42-72
  3.1 突变位点的筛选  42-45
    3.1.1 突变位点的选择及突变引物的设计  42-44
    3.1.2 突变质粒的获得与序列测定  44-45
  3.2 VPg 突变体在本氏烟上的致病性  45-56
    3.2.1 突变体在本氏烟上的症状  45-51
    3.2.2 突变体浸润本氏烟后的 RT-PCR 检测  51-52
    3.2.3 突变体对病毒浓度的影响  52-53
    3.2.4 突变体对病毒 RNA 积累水平的影响  53-54
    3.2.5 突变对病毒在本氏烟细胞间移动能力的影响  54-56
  3.3 TVBMV VPg 及其突变体自身互作  56-59
    3.3.1 YTHS 分析结果  56-58
    3.3.2 BiFC 分析结果  58-59
  3.4 VPg 及其突变体与 eIF4E 的互作  59-66
    3.4.1 eIF4E 和 eIF(iso)4E 基因的克隆  59-60
    3.4.2 VPg 与 eIF4E 和 eIF(iso)4E 的互作分析  60-62
    3.4.3 VPg 突变体与 eIF(iso)4E-2 基因互作的 YTHS 分析  62-65
    3.4.4 VPg 突变体与 eIF(iso)4E-2 基因互作的 BiFC 分析  65-66
  3.5 VPg 突变对 TVBMV 在普通烟上致病性的影响  66-72
    3.5.1 TVBMV 及突变体在普通烟上的症状  66-71
    3.5.2 TVBMV 及 VPg 突变体在普通烟中的病毒浓度分析  71-72
4 结论与讨论  72-78
  4.1 关于突变位点的筛选  72-73
  4.2 不同位点的突变对病毒致病性的影响  73-78
    4.2.1 VPg 第 10、40 和 54 位的突变对病毒致病性的影响  73-74
    4.2.2 VPg 第 42 和 45 位的突变对病毒致病性的影响  74
    4.2.3 VPg 第 64 位的突变对病毒致病性的影响  74-75
    4.2.4 VPg 第 183 位的突变对病毒致病性的影响  75-76
    4.2.5 TVBMV VPg 与 eIF(iso)4E 的互作  76-78
参考文献  78-94
致谢  94

病毒基因组连接蛋白影响烟草脉带花叶病毒致病性的机制

内容摘要

全文目录

相似论文