学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）群体遗传结构分析及与RBSDV P8互作玉米蛋白的鉴定

作　者: 阴筱
导　师: 李向东
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 玉米粗缩病水稻黑条矮缩病毒南方水稻黑条矮缩病毒群体变异互作
分类号: S435.111.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 29次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

玉米是我国重要的粮食作物、饲料作物和工业原料。病害的发生给我国玉米生产造成了严重损失，其中粗缩病可导致玉米严重减产，甚至绝产，是玉米上危害最严重的病害之一。引起我国玉米粗缩病的主要是呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）的水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）。RBSDV的病原特征、传播途径等生物学特性和基因结构以及功能解析已有所研究，但其分子变异、进化机制和致病机理还不十分清楚。由于田间寄主植物和传毒昆虫的发生数量、带毒率与玉米粗缩病的发生密切相关，了解RBSDV田间寄主，及时检测传毒介体灰飞虱的带毒率，对于制定玉米粗缩病的防控措施具有重要意义；明确影响RBSDV进化的因素，了解病毒在自然条件下的进化趋势，研究病毒与寄主间的互作，可为抗病品种选育及病毒病的可持续控制提供理论指导。本研究建立并优化了RBSDV的检测体系，明确了RBSDV的田间寄主，测定了RBSDV重排体SDZZ10的全基因组序列，从山东玉米上检测到南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV），分析了RBSDV的群体遗传结构，并鉴定了玉米中与RBSDV P8互作的蛋白。具体结果如下：1、针对RBSDV的S10片段设计了4对引物，通过比较不同的Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量、退火温度、检测引物建立了最佳RT-PCR检测体系：10×PCR buffer2.5μL，25mM MgCl21.5μL，dNTP (each2.5mM)2.0μL，检测引物F4（5’-AGY GAA GAA TTTGTA GGT GTG-3’）和R4（5’-GTT TCA ACA AAT GAC GCT AC-3’）(10μM)各1.0μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL,模板RNA5.0μL，加11.8μL水将体系补至25μL。利用这一体系可以从单头灰飞虱和30ng玉米样品提取的总RNA中检测到病毒的存在，同时从禾本科的牛筋草（Eleusine indica）、野燕麦（Avena fatua）、马唐（Digitariasanguinalis）、稗草（Echinochloa crusgalli）、狗尾草（Setaria viridis）、狗牙根（Cynodondactylon），菊科苣荬菜（Sonchus brachyotus）、醴肠（Eclipta prostrata），苋科的反枝苋（Amaranthus retroflexus）等均检测到RBSDV，首次发现双子叶植物苣荬菜、反枝苋也是RBSDV的自然寄主。2、测定了RBSDV分离物SDZZ10所有可读框（ORF）的序列，与已知的2个RBSDV分离物Hbm和Zjr全基因组序列比较，SDZZ10的大多数ORF与Hbm相应ORF的核苷酸序列一致率更高，其蛋白与Hbm相应蛋白的氨基酸一致率也更高，但SDZZ10的ORF3，ORF4，ORF9-2和ORF10与Zjr相应ORF的核苷酸一致率更高，P4，P9-1和P9-2与Zjr相应蛋白的氨基酸一致率更高。在ORF8和ORF10的系统进化树中，SDZZ10分别属于不同的组，说明SDZZ10是一个自然发生的重排体。3、测定了南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）分离物JNi4的S7-S10基因序列。JNi4的S7到S10和RBSDV相应片段的核苷酸一致率分别为72.6-73.1%，72.3-73%，73.9-74.5%和77.3-79%，与SRBSDV HN和GD分离物相应片段的一致率为99.7%，99.1%-99.7%，98.9%-99.5%和98.6%-99.2%。JNi4在根据S7到S10基因组序列构建的系统发生树中和GD、HN形成一个独立的分枝。这些结果证实了SRBSDV作为斐济病毒属一个独立种的观点，证明JNi4是SRBSDV的一个分离物。山东是目前为止发生SRBSDV的最北地区。4、测定了来自山东、江苏和安徽等地水稻和玉米101个RBSDV分离物的S8（S8包含一个开放阅读框ORF8，编码次要衣壳蛋白）和103个分离物的S10（ORF10编码主要衣壳蛋白）的序列。RBSDV的S8和S10基因处于负选择。RBSDV三个分离物的S8和两个分离物的S10存在明确的重组现象。中国RBSDV种群根据S8基因可以分为3个组，而根据S10基因可以分为2个组，分组与分离物的地理和寄主来源之间没有相关性。在同时获得S8和S10序列的85个分离物中有17个是组间重排体，30个是亚组间重排体。不同地区和不同寄主的RBSDV亚种群内和亚种群间基因交流频繁，来自中国玉米的种群处在扩张趋势。未发现RBSDV新谱系。这些结果表明重组、重排、负向选择压力及基因交流是影响中国RBSDV进化的重要因素。5、根据SDZZ10S8序列构建了诱饵载体质粒pGBKT7-S8，利用酵母双杂系统从玉米cDNA文库中筛选与RBSDV P8互作的玉米蛋白。经假阳性排除、序列测定以及在GenBank数据库中blast检索，初步筛选到26种可能互作的蛋白，并进一步证实玉米40S核糖体蛋白S13可以和RBSDV P8互作。为了确定与P8互作的40S核糖体蛋白S13的区域，将其基因平均分为三段（N端、M段、C端）。按照N、M、C、N+M和M+C进行PCR扩增，并将片段正确连入相应载体中构建了5个缺失突变体，分别进行酵母验证和荧光双分子互补验证，结果表明40S核糖体蛋白S13与RBSDV P8互作的区域为N端和C端。

全文目录

符号说明  5-9
中文摘要  9-11
Abstract  11-14
1 引言  14-32
  1.1 玉米粗缩病发生概况  14-16
    1.1.1 玉米粗缩病的分布及危害  14-15
    1.1.2 玉米粗缩病流行原因  15-16
  1.2 玉米粗缩病病原  16-24
    1.2.1 水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）  17-21
    1.2.2 南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）  21-24
  1.3 玉米粗缩病病原的检测方法  24
  1.4 植物病毒群体遗传结构  24-27
    1.4.1 植物病毒遗传变异  24-26
    1.4.2 植物病毒群体遗传结构分析方法和特点  26-27
  1.5 蛋白互作研究技术  27-30
    1.5.1 酵母双杂交系统（YTHS）  28-30
    1.5.2 荧光双分子互补技术（BiFC）  30
  1.6 本研究的目的和意义  30-32
2 材料与方法  32-55
  2.1 材料  32
    2.1.1 植物材料  32
    2.1.2 菌株及其它生化试剂  32
    2.1.3 主要实验仪器  32
  2.2 试验方法  32-55
    2.2.1 RBSDV 检测体系的建立  32-34
    2.2.2 RBSDV 基因扩增  34-35
    2.2.3 SRBSDV 基因扩增  35-38
    2.2.4 目的片段连接克隆载体测序  38-41
    2.2.5 RBSDV 分离物 SDZZ10 基因结构分析  41
    2.2.6 SRBSDV 分离物 JNi4 基因结构分析  41-42
    2.2.7 RBSDV 种群的遗传变异分析  42-44
    2.2.8 与 RBSDVB P8 互作玉米蛋白的筛选  44-55
3 结果与分析  55-85
  3.1 RBSDV 的检测  55-56
    3.1.1 最适检测体系及程序  55-56
    3.1.2 田间杂草及灰飞虱带毒情况  56
  3.2 RBSDV 分离物 SDZZ10 全基因组序列分析  56-60
    3.2.1 基因组扩增和测序  56
    3.2.2 基因结构  56-57
    3.2.3 序列一致率  57-58
    3.2.4 系统发育关系  58-60
  3.3 SRBSDV 分离物 JNI4 S7-S10 基因序列  60-64
    3.3.1 基因组扩增测定  60-61
    3.3.6 基因组结构  61
    3.3.7 核苷酸和氨基酸一致率  61-62
    3.3.8 系统发育关系  62-64
  3.4 RBSDV 遗传结构分析  64-75
    3.4.1 S8 和 S10 基因扩增  64-65
    3.4.2 S8 和 S10 基因结构  65
    3.4.3 重组分析  65-66
    3.4.4 系统发育关系  66-70
    3.4.5 S8 和 S10 ORF 的选择压力  70-71
    3.4.6 种群统计分析和中性测试  71-74
    3.4.7 种群的遗传分化和基因流  74-75
  3.5 与 RBSDV-P8 互作的玉米蛋白  75-85
    3.5.1 构建诱饵菌株  75-76
    3.5.2 cDNA 文库构建及质量鉴定  76-78
    3.5.3 初步筛选序列在 NCBI 上的同源性比较  78
    3.5.4 40S 核糖体蛋白 S13 cDNA 全长的克隆  78-79
    3.5.5 完整 40S 核糖体蛋白 S13 与 RBSDV-P8 互作  79-81
    3.5.6 40S 核糖体蛋白 S13 互作的关键区域  81-85
4 讨论  85-91
  4.1 水稻黑条矮缩病毒检测体系的建立  85
  4.2 水稻黑条矮缩病全基因组  85-86
  4.3 南方水稻黑条矮缩病毒的基因组  86-87
  4.4 水稻黑条矮缩病毒的群体遗传结构  87-89
  4.5 与 RBSDV P8 互作的玉米蛋白  89-91
5 结论  91-92
参考文献  92-103
附录  103-107
致谢  107-108
攻读学位期间发表论文情况  108-109
博士学位论文内容简介及自评  109

水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）群体遗传结构分析及与RBSDV P8互作玉米蛋白的鉴定

内容摘要

全文目录

相似论文