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梨火疫病菌中未配对的luxR同源基因的功能初析以及ExpR蛋白的原核表达及纯化

作　者: 徐恩丽
导　师: 胡白石
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 梨火疫病菌群体感应未配对的luxR 原核表达生物学特性
分类号: S436.612
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)能够引起仁果类果树及一些蔷薇科植物的火疫病害,造成严重的经济损失,是一类具有毁灭性危害的细菌性病害。目前,人们已经对梨火疫病菌的致病机理进行了广泛的研究,为进一步有效防治火疫病打下了坚实的基础。细菌是社会生态系统内的微生物,可以与相邻细菌彼此联系。细菌根据特定信号分子的浓度可以监测周围环境中自身或其它细菌的数量变化,当信号达到一定的浓度闽值时,能启动菌体中相关基因的表达来适应环境中的变化,这一调控系统被称为细菌的群体感应系统(Quorum sensing)。群体感应是一个复杂的依靠细胞密度控制毒力,胞外酶合成,运动,营养摄入,及生物膜形成的调控系统。Qs代表了革兰氏阴性菌调节基因的主要模式表达。LuxR家族转录因子是一类分布广泛和功能多样的调控因子,属于四环素蛋白家族。它可以激活和抑制许多基因的表达,包括调控相邻基因和自我调控,从而涉及许多重要的生理活动,如致病因子的产生,生物膜的形成,群体感应(QS),乙酸代谢,运动,发光,生态竞争等。我们总结了LuxR家族转录调控因子的相关机制和多样性的功能,它们结合特异性DNA蛋白序列,通过增强或衰减,以确保靶基因的准确表达。luxR型转录调节因子是广泛分布于革兰氏阴性细菌的四环素蛋白家族转录因子成员,含有一个螺旋的HTH C-末端的DNA结合域。本研究首次鉴定并克隆出了梨火疫病菌的未配对的luxR同源基因EaluxR。利用插入突变的方法,获得luxR的突变体EaΔluxR及其互补子EaΔlwxR(pBBRRH),进而初步研究了该基因对一些生物学特性的影响。研究结果表明,与野生型病菌的强致病力相比,luxR转录调控因子的突变株对于梨叶及梨幼果的的致病性明显减弱,在NA液体培养基上的生长速度明显减慢,对耐过氧化氢及胞外多糖产生能力明显减弱,但是,对烟草过敏性反应,抗生素耐性,生物膜形成没有任何影响。群体感应(Quorum sensing, QS)就是细菌根据细胞密度的变化而进行基因表达调控的生理行为。革兰氏阴性菌的群体感应系统主要受LuxI-LuxR型蛋白的调控。其中,LuxR蛋白在作为信号分子的受体蛋白的同时,还能激活一系列相关基因的表达。本研究在本实验室已有的研究工作的基础上,采用PCR法扩增了EaexpR基因编码区,经酶切鉴定、序列分析后,将其克隆至原核表达载体pET28a中,得到重组质粒pET28a22801。该重组质粒转化大肠杆菌Rosepta(DE3)pLysS感受态细胞并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出子量约28kDa的融合蛋白。该蛋白以包涵体和可溶体形式存在。

全文目录

目录  4-8
摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
上篇：文献综述  12-44
  第一章梨火疫病菌  12-20
    1 梨火疫病菌的简史、传播及防治  12-20
      1.1 梨火疫病菌简史及危害症状  12-14
        1.1.1 梨火疫病菌简史  12
        1.1.2 症状  12-14
      1.2 梨火疫病菌的病原生物学  14
      1.3 梨火疫病菌的世界分布及寄主范围  14-15
      1.4 梨火疫病菌的传播、侵染及病害循环  15-16
        1.4.1 梨火疫病菌的传播  15
        1.4.2 梨火疫病菌的侵染  15
        1.4.3 梨火疫病害防治  15-16
      1.5 梨火疫病菌的检验检疫方法  16
      1.6 基因的水平转移与病原菌的进化  16-17
      1.7 梨火疫病原菌发病分子机制  17-20
  第二章细菌群体感应系统概述  20-44
    1 细菌的群体感应  20-27
      1.1 群体感应系统组成与类型  20-22
        1.1.1 革兰阳性菌中寡肽介导的双组分感应系统  20
        1.1.2 革兰阴性菌的AHL—LuxI/luxR系统  20
        1.1.3 LuxS/AI-2依赖的QS系统  20-21
        1.1.4 其他QS系统  21-22
      1.2 细菌感知种内数量的QS系统  22-25
        1.2.1 革兰氏阴性细菌中感知种内数量的QS系统  22-23
        1.2.2 革兰氏阳性细菌中感知种内数量的QS系统  23-24
        1.2.3 细菌感知种间数量的QS系统  24-25
      1.3 微生物群体感应在感染性疾病治疗新策略中的潜在应用  25-27
        1.3.1 生物膜与抗性  25
        1.3.2 群体感应与新药物靶标  25-26
        1.3.3 群体感应抑制剂  26-27
        1.3.4 群体感应淬灭酶  27
    2 群体感应LuxR家族蛋白  27-42
      2.1 独立的LuxR同源物  28
      2.2 LuxR家族调控蛋白的结构  28-31
        2.2.1 LuxR的结构特点  28-29
        2.2.2 LuxR与目的基因的相互作用  29-30
        2.2.3 LuxR在细菌中的分布  30-31
      2.3 未配对的luxR家族：信号分子的感应因子/调节因子  31-41
        2.3.1 未配对的LuxR受体蛋白的工作模式  33-34
        2.3.2 产AHL细菌中未配对的LuxR蛋白  34-37
        2.3.3 不产AHL细菌中的未配对的LuxR  37-40
        2.3.4 结论  40-41
      2.4 luxR同源蛋白  41-42
    3 展望  42-44
下篇：研究内容  44-82
  第一章梨火疫病菌中未配对的LUXR同源基因的功能初析  44-66
    摘要  44-45
    1 材料及方法  45-54
      1.1 材料  45-48
      1.2 方法  48-54
        1.2.1 培养条件  48
        1.2.2 方法  48-52
        1.2.3 luxR基因突变体EaAluxR及互补菌株EaAluxR(pBBRRH)的构建  52-53
        1.2.4 luxR基因对梨火疫病菌生物学特性的影响  53-54
    2 结果与分析  54-63
      2.1 梨火疫病菌luxR基因的克隆及序列分析  55
      2.2 luxR基因突变株EaAluxR及互补菌株的构建  55-56
      2.3 梨火疫病菌luxR突变体的Southern杂交检测及互补株验证  56-57
      2.4 luxR基因对梨火疫病菌生物学特性的影响  57-63
        2.4.1 luxR基因能够对梨火疫病菌的致病性产生影响  57-58
        2.4.2 luxR基因能够对梨火疫病菌的生长产生影响  58-59
        2.4.3 luxR基因能够对梨火疫病菌的抗氧化压力产生影响  59-60
        2.4.4 luxR基因对梨火疫病菌的应答反应产生影响  60
        2.4.5 胞外多糖分泌量的检测  60-62
        2.4.6 luxR基因能够对梨火疫病菌对抗生素的耐受性不产生影响  62
        2.4.7 luxR基因对梨火疫病菌的烟草过敏性反应没有影响  62-63
    3 讨论  63-66
  第二章梨火疫病菌EXPR蛋白的原核表达及纯化  66-82
    摘要  66-67
    1 材料及方法  67-75
      1.1 材料  67-69
        1.1.1 菌株和载体  67
        1.1.2 培养基  67
        1.1.3 单向电泳试剂  67-68
        1.1.4 缓冲液配制  68
        1.1.5 包涵体透析复性所用缓冲液(pH7.0)  68
        1.1.6 试剂配制  68-69
      1.2 试验方法  69-75
        1.2.1 梨火疫NCPPB1665基因组及质粒的大量提取参见第一章  69
        1.2.2 感受态细胞的制备参见第一章  69
        1.2.3 连接产物的转化参见第一章  69
        1.2.4 EaexpR基因引物设计  69-70
        1.2.5 pMD18-T-EaexpR阳性克隆载体的构建  70-71
          1.2.5.1 PCR反应体系  70
          1.2.5.2 PCR产物纯化  70
          1.2.5.3 将纯化后产物与克隆载体PMD18-T载体连接，连接体系  70-71
          1.2.5.4 阳性克隆的筛选  71
        1.2.6 Rosepta(DE3)pLysS-pET28a-expR表达载体的构建  71-72
        1.2.7 SDS-PAGE检测目的蛋白  72
        1.2.8 细胞破碎  72-73
        1.2.9 目的蛋白表达的鉴定  73-75
    2 结果与分析  75-79
      2.1 EaexpR基因克隆载体的构建  75-76
      2.2 原核表达载体Rosepta(DE3)pLysS-pET28a-expR的构建验证  76
      2.3 目的蛋白的表达鉴定  76-77
      2.4 目的蛋白的纯化结果  77-79
    3 结果讨论  79-82
参考文献  82-92
发表论文  92-94
致谢  94

梨火疫病菌中未配对的luxR同源基因的功能初析以及ExpR蛋白的原核表达及纯化

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